强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞HLA-B27抗原的纯化

中华风湿病学杂志 2000年第4期第4卷 论著

作者：官健　金大地　史占军　丁红　陆洁　曹琼　武大林

单位：官健(510515 广州，第一军医大学南方医院脊柱骨病科)；金大地(510515 广州，第一军医大学南方医院脊柱骨病科)；史占军(510515 广州，第一军医大学南方医院脊柱骨病科)　丁红(外科实验室)　陆洁(外科实验室)　曹琼(外科实验室)　武大林(外科实验室)

关键词：脊柱炎，强直性；色谱法，亲和；HLA-B27抗原

　　【摘　要】　目的　纯化强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞表面的HLA-B27抗原。方法　HLA-B27单抗(FD705)亲和层析法。结果　纯化的抗原蛋白经SDS-PAGE显示为单一条带，经分析其相对分子量为56 400。结论　经此法可成功纯化强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞HLA-B27抗原。

Purification of HLA-B27 on peripheral blood mononuclear cells from patients with ankylosing spondylitis

GUAN Jian,JIN Dadi,SHI Zhanjun,et al.

　　Department of Orthopaedics,Nanfang Hospital,First Military Medical University,Guangzhou 510515,China

　　【Abstract】　Objective　To purify HLA-B27 on the surface of peripheral blood mononuclear cells from patients with ankylosing spondylitis.Method　Specific affinity column,cyanogen bromide-activated sepharose 4B column coupled to anti-HLA-B27 monoclonal antibodies,was used for HLA-B27 purification.Results　The purified antigen by this method showed a single band by SDS-PAGE,with a molecular mass of 56 400.Conclusion　HLA-B27 on the surface of peripheral blood mononuclear cells from patients with ankylosing spondylitis is successfully purified.

　　【Key words】　Spondylitis,ankylosing；　Chromatography,affinity；　HLA-B27 antigen

　　强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种主要侵犯中轴关节，以骶髂关节炎和脊柱强直为主要特点的风湿性疾病。病因及发病机制迄今未明。AS和HLA-B27之间存在着密切联系。本实验采用亲和层析法对AS患者外周血中的单个核细胞表面的HLA-B27抗原进行了纯化，旨在为进一步研究HLA-B27在AS发病中的作用提供物质基础。

　　1　资料与方法

　　1.1　病例来源

　　2例AS患者(经两种方法，PCR-SSP和单抗板细胞毒反应，确定为HLA-B27阳性)，均发生双髋关节强直于屈髋位，于我院施行双侧全髋假体置换手术，收集术中失血备用。

　　1.2　方法

　　1.2.1　单个核细胞分离：采用Ficoll淋巴细胞分离液进行，收集上层细胞，用生理盐水反复清洗后－80℃冻存。

　　1.2.2　亲和层析柱的制备：采用溴化氰活化的Sepharose 4B(Pharmacia)，每毫升凝胶约连接HLA-B27单抗(FD705，Lambda)2 mg，4 ℃保存于Tris缓冲液(0.025 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，0.02% NaN₃，pH 7.3)中。具体制备方法参照文献［1］。

　　1.2.3　HLA-B27的纯化：参照Boisgérault等^［2］的方法。具体如下：将分离的单个核细胞(10⁸～10⁹)裂解于TES (0.05 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，pH 7.4)缓冲液中，其中含Aprotinin 1%，Pepstatin 10^－5mol/L，Leupeptin 10^-5mol/L，苯甲基磺酰氟化物2 mmol/L，碘化乙酰胺2.5 mmol/L，NP-40 1%，4 ℃处理1 h后，100 000×g离心1 h。取上清液按以下顺序过柱：①连接正常小鼠IgG的溴化氰活化的Sepharose 4B柱；②连接HLA-B27单抗的溴化氰活化的Sepharose 4B柱。完成后以大量TES缓冲液洗柱，然后用0.05 mol/L乙二胺，pH 11.5，将两柱分别洗脱，洗脱液以1 mol/L Tris，pH 7.4，立即中和，将此液以蒸馏水透析后冻干备用。

　　1.2.4　SDS-PAGE分析纯度：采用12%分离胶，以0.1%考马斯亮蓝R250(水∶甲醇∶冰醋酸＝5∶5∶2配制)染色1 h，放入含40%甲醇和10%冰醋酸的水溶液中脱色至背景清晰。用凝胶图像光密度分析系统(UVP-GDS7500型)扫描并分析条带相对分子量。

　　2　结　　　果

　　Marker选用低分子量标准蛋白(珠海东风生化试剂厂)，经亲和层析法分离、纯化的蛋白在SDS-PAGE中显示为单一条带，经分析其相对分子量为56 400。

　　3　讨　　　论

　　AS好发于青壮年男性，患者可因疼痛、活动受限和逐渐发展的畸形而严重影响劳动力和生活质量，而患者家庭因需支付长期的医疗费用而负担沉重，故研究AS的发病机制及临床诊治意义重大。1973年Brewerton等^［3］发现人类组织相容性Ⅰ类抗原HLA-B27与AS发病密切相关，90%以上AS患者表达HLA-B27，而一般人群中HLA-B27阳性率只有3%～7%。迄今为止，在发现的所有与疾病相关的HLA抗原中，HLA-B27与AS的相关性最大。

　　HLA-B27分子是由2条多肽链组成的，一条是α链或重链，约44 000，包括3个侧链α₁、α₂和α₃，它们与另一条β链或轻链，即β₂微球蛋白(约12 000)结合共同组成B27分子，其相对分子量约56 000。以往纯化的HLA-B27分子均来源于HLA-B27基因转染的细胞株，然后对其提呈的多肽进行研究，但这不能反映体内的真实情况，更无法比较出B27(＋)AS患者与B27(＋)正常人群的差异。为实现这一目的，本实验采用了HLA-B27单抗—FD705(与其他抗原无交叉反应)亲和层析法纯化AS患者外周血单个核细胞表面的HLA-B27抗原。结果显示，经此法纯化的抗原蛋白在SDS-PAGE中显示为单一条带，分析其相对分子量为56 400，证实为高纯度的HLA-B27抗原。本实验在国内外尚未见报道，对进一步研究HLA-B27与AS发病的关系具有重要意义。

参 考 文 献

　　1.白英，沈倍奋，程知义，等.单克隆抗体在临床医学中的应用.北京：人民军医出版社，1985.289-308.

　　2.Boisgérault F,Khalil I,Tieng V,et al.Definition of the HLA-A29 peptide ligand motif allows prediction of potential T-cell epitopes from the retinal soluble antigen,a candidate autoantigen in birdshot retinopathy.Proc Natl Acad Sci USA,1996，93:3466-3470.

　　3.Brewerton DA,Hart FD,Caffrey M,et al.Ankylosing spondylitis and HLA-B27.Lancet,1973,1:904-907.

(收稿日期：1999-11-12)