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强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞HLA-B27抗原的纯化

强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞HLA-B27抗原的纯化

中华风湿病学杂志 2000年第4期第4卷 论著

作者:官健 金大地 史占军 丁红 陆洁 曹琼 武大林

单位:官健(510515 广州,第一军医大学南方医院脊柱骨病科);金大地(510515 广州,第一军医大学南方医院脊柱骨病科);史占军(510515 广州,第一军医大学南方医院脊柱骨病科) 丁红(外科实验室) 陆洁(外科实验室) 曹琼(外科实验室) 武大林(外科实验室)

关键词:脊柱炎,强直性;色谱法,亲和;HLA-B27抗原

  【摘 要】 目的 纯化强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞表面的HLA-B27抗原。方法 HLA-B27单抗(FD705)亲和层析法。结果 纯化的抗原蛋白经SDS-PAGE显示为单一条带,经分析其相对分子量为56 400。结论 经此法可成功纯化强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞HLA-B27抗原。

Purification of HLA-B27 on peripheral blood mononuclear cells from patients with ankylosing spondylitis

GUAN Jian,JIN Dadi,SHI Zhanjun,et al.

  Department of Orthopaedics,Nanfang Hospital,First Military Medical University,Guangzhou 510515,China

  【Abstract】 Objective To purify HLA-B27 on the surface of peripheral blood mononuclear cells from patients with ankylosing spondylitis.Method Specific affinity column,cyanogen bromide-activated sepharose 4B column coupled to anti-HLA-B27 monoclonal antibodies,was used for HLA-B27 purification.Results The purified antigen by this method showed a single band by SDS-PAGE,with a molecular mass of 56 400.Conclusion HLA-B27 on the surface of peripheral blood mononuclear cells from patients with ankylosing spondylitis is successfully purified.

  【Key words】 Spondylitis,ankylosing; Chromatography,affinity; HLA-B27 antigen

  强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种主要侵犯中轴关节,以骶髂关节炎和脊柱强直为主要特点的风湿性疾病。病因及发病机制迄今未明。AS和HLA-B27之间存在着密切联系。本实验采用亲和层析法对AS患者外周血中的单个核细胞表面的HLA-B27抗原进行了纯化,旨在为进一步研究HLA-B27在AS发病中的作用提供物质基础。

  1 资料与方法

  1.1 病例来源

  2例AS患者(经两种方法,PCR-SSP和单抗板细胞毒反应,确定为HLA-B27阳性),均发生双髋关节强直于屈髋位,于我院施行双侧全髋假体置换手术,收集术中失血备用。

  1.2 方法

  1.2.1 单个核细胞分离:采用Ficoll淋巴细胞分离液进行,收集上层细胞,用生理盐水反复清洗后-80℃冻存。

  1.2.2 亲和层析柱的制备:采用溴化氰活化的Sepharose 4B(Pharmacia),每毫升凝胶约连接HLA-B27单抗(FD705,Lambda)2 mg,4 ℃保存于Tris缓冲液(0.025 mol/L Tris,0.15 mol/L NaCl,0.02% NaN3,pH 7.3)中。具体制备方法参照文献[1]。

  1.2.3 HLA-B27的纯化:参照Boisgérault等[2]的方法。具体如下:将分离的单个核细胞(108~109)裂解于TES (0.05 mol/L Tris,0.15 mol/L NaCl,5 mmol/L EDTA,pH 7.4)缓冲液中,其中含Aprotinin 1%,Pepstatin 10-5mol/L,Leupeptin 10-5mol/L,苯甲基磺酰氟化物2 mmol/L,碘化乙酰胺2.5 mmol/L,NP-40 1%,4 ℃处理1 h后,100 000×g离心1 h。取上清液按以下顺序过柱:①连接正常小鼠IgG的溴化氰活化的Sepharose 4B柱;②连接HLA-B27单抗的溴化氰活化的Sepharose 4B柱。完成后以大量TES缓冲液洗柱,然后用0.05 mol/L乙二胺,pH 11.5,将两柱分别洗脱,洗脱液以1 mol/L Tris,pH 7.4,立即中和,将此液以蒸馏水透析后冻干备用。

  1.2.4 SDS-PAGE分析纯度:采用12%分离胶,以0.1%考马斯亮蓝R250(水∶甲醇∶冰醋酸=5∶5∶2配制)染色1 h,放入含40%甲醇和10%冰醋酸的水溶液中脱色至背景清晰。用凝胶图像光密度分析系统(UVP-GDS7500型)扫描并分析条带相对分子量。

  2 结   果

  Marker选用低分子量标准蛋白(珠海东风生化试剂厂),经亲和层析法分离、纯化的蛋白在SDS-PAGE中显示为单一条带,经分析其相对分子量为56 400。

  3 讨   论

  AS好发于青壮年男性,患者可因疼痛、活动受限和逐渐发展的畸形而严重影响劳动力和生活质量,而患者家庭因需支付长期的医疗费用而负担沉重,故研究AS的发病机制及临床诊治意义重大。1973年Brewerton等[3]发现类组织相容性Ⅰ类抗原HLA-B27与AS发病密切相关,90%以上AS患者表达HLA-B27,而一般群中HLA-B27阳性率只有3%~7%。迄今为止,在发现的所有与疾病相关的HLA抗原中,HLA-B27与AS的相关性最大。

  HLA-B27分子是由2条多肽链组成的,一条是α链或重链,约44 000,包括3个侧链α1、α2和α3,它们与另一条β链或轻链,即β2微球蛋白(约12 000)结合共同组成B27分子,其相对分子量约56 000。以往纯化的HLA-B27分子均来源于HLA-B27基因转染的细胞株,然后对其提呈的多肽进行研究,但这不能反映体内的真实情况,更无法比较出B27(+)AS患者与B27(+)正常群的差异。为实现这一目的,本实验采用了HLA-B27单抗—FD705(与其他抗原无交叉反应)亲和层析法纯化AS患者外周血单个核细胞表面的HLA-B27抗原。结果显示,经此法纯化的抗原蛋白在SDS-PAGE中显示为单一条带,分析其相对分子量为56 400,证实为高纯度的HLA-B27抗原。本实验在国内外尚未见报道,对进一步研究HLA-B27与AS发病的关系具有重要意义。

参 考 文 献

  1.白英,沈倍奋,程知义,等.单克隆抗体在临床医学中的应用.北京:民军医出版社,1985.289-308.

  2.Boisgérault F,Khalil I,Tieng V,et al.Definition of the HLA-A29 peptide ligand motif allows prediction of potential T-cell epitopes from the retinal soluble antigen,a candidate autoantigen in birdshot retinopathy.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:3466-3470.

  3.Brewerton DA,Hart FD,Caffrey M,et al.Ankylosing spondylitis and HLA-B27.Lancet,1973,1:904-907.

(收稿日期:1999-11-12)


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