胃癌组织中P15蛋白和血管内皮生长因子表达及其相关性的研究

　　中国胃肠外科杂志2000年第3卷第2期

陈启　赵宗刚　李占武

　　摘　要　目的　研究胃癌组织中P15蛋白和血管内皮生长因子(VEGF)的表达及相关性。方法　应用SP免疫组织化学方法检测了160例胃癌和52例胃良性病变中P15蛋白和VEGF的表达情况。结果　P15蛋白在胃癌中阳性率为43.8%(70/160例)，在胃良性病变中的阳性率为69.2%(36/52例)(P＜0.05)。VEGF在胃癌中的阳性表达率为75.0%(120/160例)，在胃良性病变中的阳性表达率为7.7%(4/52例)(P＜0.001)。P15蛋白阳性/VEGF阴性表达率于胃癌中为11.3%(18/160例)，胃良性病变中为69.2%(36/52例)(P＜0.001)；P15蛋白阴性/VEGF阳性表达率于胃癌中为42.5%(68/160例)，胃良性病变中为7.7%(4/52例)(P＜0.001)。结论　胃癌中存在P15蛋白下调和VEGF上调，且两者具有相关性。

　　关键词：胃癌　P15蛋白　血管内皮生长因子

　　目前关于P53与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的关系已有研究^［1］，P15与VEGF的关系未见报道。本文应用免疫组织化学方法研究P15蛋白和VEGF在胃癌组织中的表达及相关性。

　　材料与方法

　　一.标本

　　160例胃癌标本取自我院1994年1月至1995年12月术后石蜡包埋标本，病理证实为胃癌。另取52例胃良性病变(浅表性胃炎22例，萎缩性胃炎30例)作对照组,采用同样方法做成石蜡标本。

　　二. 方法

　　所有标本均经酒精固定，常规组织脱水，石蜡包埋，4μm厚连续切片，分别进行苏木精和伊红染色(HE)和免疫组织化学染色，应用SP免疫组织化学方法检测P15蛋白和VEGF的表达。兔抗人P15蛋白抗体(1/100)和兔抗人VEGF抗体(1/100)均购自Santa gruz公司。生物素标记物羊抗兔IgG、SP试剂和DAB试剂均购自北京中山生物技术有限公司。用已判定为阳性的切片作为阳性对照，以0.01 m PBS(pH=7.4)替代第一抗体作为每次染色的阴性对照。细胞浆或细胞核呈棕黄色颗粒者为P15蛋白、VEGF阳性细胞。阳性标准：P15和VEGF阳性分级按下述标准记录：无棕黄色颗粒为(-)，阳性细胞数＜25%为(±)，阳性细胞数25%～50%为(+)，阳性细胞数＞50%为(++)。

　　三. 统计学处理

　　采用四格表卡方检验。

　　结　　果

　　一.胃癌与胃良性病变中P15蛋白和VEGF表达特征及表达比较

　　P15蛋白阳性物质主要分布于细胞核，部分见胞浆着色。VEGF阳性物质分布于细胞浆。本组胃癌中P15蛋白阳性70例(43.8%)，VEGF阳性120例(75.0%)。胃良性病变中P15蛋白阳性36例(69.2%)，VEGF阳性4例(7.7%)。胃癌中P15蛋白阳性病例率(43.8%)显著低于胃良性病变中阳性病变例率(69.2%)(P＜0.05)，说明胃癌中存在P15蛋白下调。胃癌中VEGF阳性病例率(75.0%)显著高于胃良性病变中阳性病变率(7.7%)(P＜0.001)，说明胃癌中存在VEGF上调。

　　二. P15蛋白和VEGF在胃癌中表达的相关性

　　160例胃癌中，P15蛋白和VEGF均阳性52例(32.5%)；P15蛋白阳性、VEGF阴性18例(11.3%)；P15蛋白阴性、VEGF阳性68例(42.5%)；P15蛋白和VEGF均阴性22例(13.8%)。应用配对资料卡方检验P＜0.001,P15蛋白和VEGF具有明显相关性。

　　三. VEGF和P15在胃癌中的表达与临床病理因素的关系

　　VEGF的表达与肿瘤的浸润深度、转移和PTNM分期有关，与肿瘤大小、组织分化无关。P15的表达与胃癌的临床病理因素无关（表1）。

　　四. 胃癌中VEGF的表达程度与临床病理因素的关系

　　VEGF的表达程度随肿瘤浸润深度、PTNM分期的增加而增强，与淋巴结或远处转移与否无关（表2）。

　　表1　胃癌中VEGF和P15蛋白表达及其与

　　临床病理因素的关系　　(例)

　　　表2　VEGF表达程度与胃癌临床病理因素的关系

　　讨　　论

　　抑癌基因P15是1994年由Beach研究小组首次报道的一种新型抑癌基因，命名为P15 iNK4B^［2］，其全部编码序列长约460 Kb，编码蛋白质含137个氨基酸，分子量为14.7 kD，定位于人体染色体9 p²¹区位。P15的抑癌机制与细胞周期调控密切相关，它是细胞周期的一种负性调控因子，可与细胞周期素D（cyclin d）竞争结合，细胞周期素依赖激酶4（CDK4）或细胞周期素依赖激酶6（CDK6）干扰cyclin d与CDK4或CDK6的结合，阻止细胞从G₁期进入S期，抑制细胞无限增殖^［2］。任何促进增殖系统成分的过度表达和抑制系统成分的缺失或降低都会产生细胞增殖的失控而导致癌^［3］。目前认为P15基因纯合子缺失或过度甲基化是P15失活的主要机制，据统计80%的癌细胞株有P15抑癌基因的失活^［4］。Stone等^［4］对几个具有黑色素瘤倾向的家族研究表明有P15抑癌基因纯合子缺失。Herman等^［5］研究表明在白血病患者中有P15抑癌基因的过度甲基化。本研究对160例胃癌和52例胃良性病变P15蛋白检测发现P15蛋白在胃癌组织中阳性表达率（43.8%）显著低于胃良性病变中阳性表达率（69.2%）（P＜0.05），说明当细胞癌变时，可引起抑癌基因的缺失或过度甲基化不能表达P15蛋白而呈阴性。本研究显示P15在胃癌发生中起重要作用，P15的表达与胃癌的临床病理因素无关。

　　肿瘤不仅通过肿瘤血管从宿主获得丰富的营养，而且通过肿瘤血管向宿主输入大量恶性细胞，导致肿瘤不断生长和转移。肿瘤的血管形成过程极为复杂，其中血管生成因子发挥重要作用。目前已经分离和纯化20多种血管生成因子和相关因子，其中研究最多的是VEGF。VEGF是Ferrara等^［6］从牛垂体滤泡星状细胞纯化分离到的一种肝素结合因子，能特异作用于血管内皮细胞，引起血管内皮细胞增殖，并在体内诱导血管形成。VEGF与恶性肿瘤的浸润、生长、转移及预后有关。目前VEGF与胃癌临床病理因素的关系尚未统一。Baba等^［7］观察到在胃硬癌中VEGF阳性表达与浸润深度、淋巴结转移、组织学分化有关。Takahashi等^［8］报道肿瘤血管计数及VEGF阳性表达随低分化髓样腺癌病期进展而升高，认为该类型胃癌是血管依赖性的。Maeda等^［9］观察到新生血管计数在VGEF阳性胃癌中明显高于VEGF阴性胃癌，VEGF阳性表达与肿瘤浸润、淋巴结转移以及肝转移有关，而且VEGF阳性患者比VEGF阴性患者预后不良。Tanigawa等^［10］发现在众多反映胃癌生物行为的指标中，除组织学类型和生长方式外，VEGF阳性表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、远处转移以及5年生存率密切相关。本文研究发现胃癌中VEGF阳性表达与浸润深度、转移（淋巴结转移和远处转移）及PTNM分期有关，与肿瘤大小、组织学类型无关。

　　本组研究显示胃癌中可能存在P15下调和VEGF上调，且两者具有相关性，其在胃癌发生发展中的机制，尚有待于进一步研究。

　　作者单位：陈启（266003　青岛，山东青岛大学医学院附属医院普通外科)

　　赵宗刚（266003　青岛，山东青岛大学医学院附属医院普通外科)

　　李占武（焦作，河南焦作市人民医院普通外科）

　　参考文献

　　1，Yamamura t, Malsuzaki H, Ozasa T, et al. Significance of P53 and VEGF expression in liver metastasis from colorectal cancer. Gan To Kagalu Kyoho 1998;25:1355-1357.

　　2，Hannon GJ, Beach D. P15INK4B is a potential factor of TGF-beta-induced cell cycle arrest. Nature 1994;371: 257-261.

　　3，Peter M, Herskowitz I. Joining the complex: cyclin-dependent kinase inhibitory proteins and the cell cycle. Cell 1994;79:181.

　　4，Stone S, Dayanath P, Jiang P, et al.Genomic structure,expression and mutational analysis of the P15 (MTS2) gene. Oncogene 1995;11:987-991.

　　5，Hermen JG,Jen J,Merlo A,et al. Hypermethylation associated inactivation indicates a tumor suppressor role for P15INK4B. Cancer Res 1995;56:722-72.

　　6，Ferrara N,Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. Biochern biophys Res Common 1989;161:851-858.

　　7，Baba M,Konno H,Marni Y, et al. Relationship of p53 and vascular endothelial growth factors in human scirrhous gastric cancer. Eur Surg Res 1998;30:130-137.

　　8，Takahashi Y, Ellis LM, Ohta T, et al. Angiogenesis in poorly differentiated medullary carcinoma of the stomach. Surg Today 1998;28:367-372.

　　9，Maeda K, Cgung YS,Ogawa Y,et al. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma.Cancer 1996;77:858-863.

　　10，Tanigawa N, Amaya H, Matsumura M, et al. Correlation between express of vascular endothelial growth factor and tumor vascularity and patient outcome in human gastric carcinoma. J Clin Oncol 1997;15:826-832.