血管内皮细胞生长因子和血管生成与胃癌发展的关系

中华病理学杂志 1998年第4期第27卷 *论著*

作者：陆敏　江悦琴　王瑞年

关键词：胃肿瘤；内皮生长因子；新生血管化；肿瘤转移

　　【摘要】　目的　探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)和血管生成与胃癌发展的关系。方法　应用免疫组织化学和原位分子杂交技术,检测56例人胃癌组织VEGF蛋白表达和微血管密度(MVD)及部分胃癌VEGF mRNA表达,分析VEGF和MVD、及其与胃癌组织学分型、浸润深度、生长方式、淋巴结转移、远处转移和预后的关系。结果　VEGF阳性者MVD值显著高于阴性者(P＜0.01), VEGF表达和MVD与胃癌浸润深度(P＜0.01)、淋巴结转移(P＜0.05)和远处转移(P＜0.05)密切相关， 而与组织学分型和生长方式无关(P＞0.05)；VEGF表达阳性或MVD≥43的胃癌患者5年生存率较低；VEGF mRNA表达与 VEGF蛋白表达具有一致性，但其分布不同。结论　VEGF与胃癌的血管生成密切相关，对胃癌的生长和浸润转移有促进作用，VEGF和MVD可作为反映胃癌生物学行为的指标之一。

　　The relationship of vascular endothelial growth factor and angiogenesis to the progression of gastric carcinoma　Lu Min, Jiang Yueqin, Wang Ruinian. Department of Pathology, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025

　　【Abstract】　Objective　To investigate the relationship of vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiogenesis to the progression of gastric carcinoma (GC).Methods　VEGF protein expression and microvessel density (MVD) in 56 cases of human GC and VEGF mRNA expression in some cases were examined by use of immunohistochemical staining and in situ hybridization technique respectively. MVD and VEGF expression were analysed together with their relation to histologic types, depth of invasion, growth pattern, lymph node metastasis, distant metastasis and relapsing rate of GC.Results　MVD was significantly higher in VEGF-positive GC than in VEGF-negative GC (P＜0.01). MVD and VEGF positively correlated with depth of invasion (P＜0.01), lymph node metastasis (P＜0.05) and distant metastasis (P＜0.05), but their relation to the histologic types and growth pattern of GC was not significant. The 5 year survival rate was significantly lower in GC patients with positive expression of VEGF or with MVD≥43. The expression of VEGF mRNA was consistent with that of VEGF protein, but the distribution is different.Conclusion　VEGF is highly related to angiogenesis of GC and promotes growth, invasion and metastasis of GC. VEGF expression or MVD is one of the predictors for the biological behavior of GC.

　　【Key words】　Stomach neoplasms　　Endothelial growth factors　　Neovascularization　　Neoplasm metastasis

　　肿瘤生长依赖于血管生成^［1］，丰富的血管可持续不断地向肿瘤提供营养和排除代谢产物,为其生长提供物质条件。肿瘤组织诱导的血管生成是一复杂的由多因素调节的过程，自从Folkman于1973年提出肿瘤血管生成因子(TAF)概念以来, 已陆续发现多种血管生成因子,如:a/bFGF,VEGF,TGFα等,其中以VEGF的作用最为突出。这些血管生成因子通过各种机制降解血管基底膜和周围的细胞外基质,促进内皮细胞分裂、游走和增殖,诱导宿主毛细血管新生并长入肿瘤组织。我们应用免疫组化和原位分子杂交技术检测人胃癌组织中VEGF表达和微血管密度(MVD)，分析VEGF与MVD,及其与胃癌各临床病理指标和预后的关系。

材料与方法

　　1.标本：1989年～1991年本校附属瑞金医院普外科手术切除胃癌标本56例，男37例，女19例，年龄33岁～80岁(平均57.6岁)。按中国常见恶性肿瘤诊治规范第四分册胃癌标准进行病理检查，并归类如下:Ⅰ高分化乳头状腺癌,Ⅱ中分化管状腺癌, Ⅲ低分化腺癌和印戒细胞癌,Ⅳ未分化癌;浸润至粘膜层(M)和粘膜下层(Sm), 固有肌层(Pm)和浆膜下层(SS), 穿透浆膜层(Se)和穿透浆膜层合并侵袭邻近脏器(Sei); 按Ming法分为膨胀型, 浸润型。详细资料见附表。取10例正常胃组织作对照。其中39例有术后5年以上随访资料。

附表　VEGF蛋白表达和MVD与胃癌各临床病理指标间关系

　　2.抗体和探针:鼠抗人Ⅷ因子相关抗原(FⅧRAg)单克隆抗体1∶100(DAKO公司), VEGF多克隆抗体1∶50(Santa Cruz公司), VEGF cDNA质粒由美国California大学Warren博士惠赠,片段长400bp，随机引物法标记,地高辛标记试剂盒购自Boehringer Mannheimn公司。

　　3.免疫组化染色:常规SP法,每次染色设置阳性及阴性对照。结果判定: 按5%以上细胞浆或细胞膜呈棕黄色染色者为VEGF蛋白表达阳性^［2］;MVD计数参照Veidner等^［3］和Maeda等^［4］报道的方法,先在低倍镜(100×)下全面观察切片以确定肿瘤内血管密度最高处。高血管密度区多位于肿瘤边缘。再在高倍镜(200×,0.74 mm² /视野)下,以与周围肿瘤细胞和结缔组织成份明显区别的任何一个棕色染色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管,只要结构不相连,其分枝结构也作为一个血管计数。记录5个视野内的微血管数,取其平均数作为该病例MVD值。

　　4.原位分子杂交：取20例标本，主要步骤：杂交前预处理；杂交：VEGF cDNA探针浓度为2 ng/μl，55℃杂交16小时;杂交后处理,显色。上述过程均在无RNase条件下进行,阴性对照用不含探针的杂交液进行杂交。以细胞浆内呈紫蓝色颗粒或团块状物为阳性。

　　5.统计学处理:MVD、VEGF蛋白表达和VEGF mRNA表达与各临床病理指标间关系分别用方差分析、χ²检验和Fisher精确检验,Logrank法作时序检验并按Kaplan-Meier法作生存率曲线。

结果

　　1.VEGF蛋白表达: 56例胃癌中25例VEGF表达阳性(44.6%，图1),其表达具明显的异质性,强阳性染色的癌细胞多位于浸润前缘,某些血管内皮细胞呈弱阳性染色,正常胃粘膜未见VEGF阳性表达。

　　图1　胃粘液细胞癌，癌细胞浆VEGF染色阳性　SP法×400　图2　胃未分化癌，微血管内皮细胞FⅧRAg染色　SP法×200　图5　胃粘液细胞癌，癌细胞浆VEGF mRNA染色阳性　原位杂交×400

　　2.MVD表达：胃癌组织中所有毛细血管、小静脉和小动脉内皮细胞均为FⅧRAg染色阳性(图2),其血管生成具异质性,即肿瘤浸润前缘的微血管较肿瘤内部的密集。56例胃癌组织的MVD从14～68个不等，±s为41.9±14.9个。

　　3.VEGF蛋白表达和MVD与各临床病理指标间关系：侵及浆膜和有淋巴结及远处转移者VEGF表达率和MVD平均值显著大于未侵及浆膜(P＜0.01)和无淋巴结转移(P＜0.01)及远处转移者(P＜0.05),见附表。

　　4.VEGF蛋白表达与MVD关系:25例VEGF表达阳性者平均MVD 53.1±11.9个，31例阴性表达者平均MVD 32.9±10.2个，两者差别非常显著(P＜0.01)。

　　5.VEGF蛋白表达和MVD与复发及预后关系：39例接受胃癌根治性手术者平均MVD 42.7±15.8个，术后5年内出现癌肿复发者16例，占41.0%(16/39例)。VEGF表达阳性者复发率为57.7%(11/19例)显著高于阴性者复发率25.0%(5/20例，P＜0.05) 。VEGF阳性患者5年生存率明显低于阴性者(P＜0.05，图3)。高MVD组(MVD≥43个)复发率63.2%(12/19例),低MVD组(MVD＜43个)20.0%,两者有显著差别,且低MVD组5年生存率明显高于高MVD组(P＜0.01，图4)。

图3　不同VEGF表达组胃癌根治术后的生存情况

　　6.VEGF mRNA表达: 20例胃癌组织12例VEGF mRNA表达阳性(60.0%，图5),其表达主要位于癌肿近中心区的癌细胞中,周围的微血管内皮细胞未见其表达,异型增生腺体可见阳性表达。正常胃组织中未见明显VEGF mRNA 表达。侵及浆膜及有淋巴结转移者VEGF mRNA表达率高于未侵及浆膜(P＜0.05)和无淋巴结转移者(P＜0.05),其中3例有远处转移者VEGF mRNA皆为阳性,不同组织分型间表达率无显著差别(P＞0.05)。

图4　不同MVD组胃癌根治术后的生存情况

　　7.VEGF mRNA与蛋白质表达比较：20例胃癌VEGF mRNA表达率60.0%(12/20例),蛋白质表达率50.0%(10/20例)。同时出现mRNA和蛋白质表达的有9例,且在同一例切片中mRNA表达范围比蛋白质表达范围广,mRNA阳性而蛋白质阴性的有3例，反之有1例,两者都无表达的有7例。

讨论

　　VEGF是一高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素,具有双重功能:(1)增加微血管通透性,促进血浆纤维蛋白外渗,为血管形成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网络;(2)通过与内皮细胞上两个特殊受体flt和flk/KDR作用,直接刺激内皮细胞增殖,并产生纤维蛋白溶酶原激活剂(组织型、尿激酶型)和胶原酶等^［5，6］,这不仅可促进内皮细胞移动,有利于血管生成，而且还有利于肿瘤细胞脱落进入血管或向邻近纤维蛋白和结缔组织基质扩散,为肿瘤的浸润转移创造条件。本研究中56例胃癌组织VEGF阳性率为44.6%,阳性表达者平均MVD值明显高于阴性表达者,与Maeda等^［4］最近报道的胃癌组织中VEGF表达情况相近。而且癌肿浸润前缘VEGF蛋白表达较其它部位明显,微血管密度也较高,血管生成活跃,说明VEGF蛋白表达与血管生成部位的一致性。Takahashi等^［7］在结肠癌研究中也报道了类似结果。丰富的血管不仅增加了肿瘤细胞进入循环的机率,而且肿瘤细胞还可以侵入邻近与毛细血管伴行的淋巴管,或通过淋巴静脉连接进入淋巴管,促进淋巴转移。因此，在众多反映胃癌生物学行为的指标中,除组织学分型和生长方式外,VEGF表达和MVD与胃癌浸润深度、淋巴结转移及远处转移均有关系。VEGF mRNA表达与浆膜浸润、淋巴结转移也密切相关。可见,VEGF在促进胃癌血管生成的同时也促进了胃癌的浸润转移。关于预后方面,本组资料显示VEGF阳性或MVD≥43的胃癌患者术后复发率较高，预后明显差于VEGF阴性或MVD＜43者,进一步证实了VEGF和血管生成在胃癌发展中的作用。

　　我们应用免疫组化和原位分子杂交技术检测同一例组织中VEGF蛋白质和mRNA表达,可见其表达部位不同。这可能是因为肿瘤中心区的细胞增殖速度较快,使间质压力增高,导致毛细血管受压闭塞和邻近肿瘤组织缺氧、坏死,VEGF mRNA表达上调。目前已在某些体外培养的肿瘤细胞和人类肿瘤中证实缺氧可使VEGF mRNA表达上调。同时,VEGF是一具有旁分泌机制的生长因子,通过其受体作用于微血管内皮细胞,我们观察到免疫组化中VEGF阳性表达的癌细胞周围微血管有VEGF弱阳性表达, 而原位分子杂交中VEGF mRNA阳性表达的癌细胞周围微血管无VEGF mRNA表达,与Brown等^［8］所见相同。值得一提的是,在某些肠化和异型增生腺体中也可见VEGF mRNA阳性表达,提示血管生成因子(如VEGF)可能于肿瘤发生早期即已分泌,以促进肿瘤发生早期的血管生成。

　　综上所述,VEGF,可通过促进胃癌的血管生成而促进胃癌的生长和浸润转移,VEGF或MVD可作为反映胃癌生物学行为的指标之一。

参考文献

　　1Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implication. N Engl J Med, 1971, 285：1182-1186.

　　2Miyake M, Taki T, Hitomi S, et al. Correlation of expression of H/Lex/leb antigen with survival in patients with carcinoma of the lung. N Engl J Med, 1992, 327：14-18.

　　3Veidner N, Folkman J, Pozza F, et al. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma. J Natl Cancer Inst, 1992, 84：1875-1886.

　　4Maeda K, Chung YS, Ogawa Y, et al. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma. Cancer, 1996, 77：858-863.

　　5Senger DR, Van de Water L, Brown LF, et al. Vascular permeability factor in tumor biology. Cancer Metastasis Rev, 1993, 12：303-324.

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　　7Takahashi Y, Kitadai Y, Bueana CD, et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptor, KDR, correlations with vascularity, metastasis and proliferation of human colon cancer. Cancer Res, 1995, 55：3964-3968.

　　8Brown LF, Berse B, Jackman RW. et al. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial grwoth factor ) and its receptors in adenocarcinoma of the gastrointestinal tract. Cancer Res, 1993, 53：4727-4735.

(收稿：1997-07-08　　修回：1998-01-22)