人食管癌相关基因在大肠杆菌中的表达

　　中华肿瘤杂志2000年第22卷第3期

王越英　唐槐静　陆士新　王德斌　苏涛　刘海玲　谭文

　　摘　要　目的　研究食管癌相关基因-1（ECRG-1）的编码蛋白质在大肠杆菌中的表达，进一步制备抗ECRG-1编码蛋白质的多克隆抗体。方法　用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）方法克隆ECRG-1基因蛋白编码序列。构建该基因的表达质粒, 在大肠杆菌中诱导表达, 以Western blot鉴定。用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE电泳）纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多抗。结果　RT-PCR所分离的ECRG-1基因蛋白编码序列，经测序证明与5′-RACE方法钓取的该基因序列相符。Western blot证实该基因编码蛋白质在大肠杆菌中表达，并获得效价为1∶3200的多克隆抗体。结论　ECRG -1基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达，并能获得抗ECRG-1基因编码蛋白质的多克隆抗体，为进一步深入研究该蛋白质的结构与功能打下了基础。

　　主题词：食管癌相关基因-1；基因克隆；基因表达；融合蛋白；多克隆抗体

　　从人类重大疾病中分离与克隆相关基因已成为国内外研究的热点，并相继在乳腺、结肠、肝脏等肿瘤中分离与克隆出一些新的基因^［1］。因此，对新克隆基因功能研究的重要性和迫切性日益突显出来，成为基因结构研究的深入与继续。我们曾用mRNA差异显示技术，从人正常食管上皮与食管癌组织中分离与克隆出4个新的基因片段^［2］。其中1个用5′RACE（rapid amplification of cDNA ends）方法钓取了cDNA全长^［3］，命名为食管癌相关基因-1（esophageal cancer related gene-1，ECRG-1）。为了解ECRG-1基因所编码蛋白质的功能，我们用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)方法分离出ECRG-1基因的蛋白编码区序列，以质粒pGEX-4T-1为表达载体，在大肠杆菌中诱导了ECRG-1基因融合蛋白的表达，并分离出该融合蛋白质，进一步制备了抗ECRG-1基因蛋白的多克隆抗体。

　　材料与方法

　　一、材料

　　1.质粒和菌株：质粒pT-Adv 购自Clontech公司，质粒pGEX-4T-1购自Pharmacia公司，大肠杆菌DH5α、BL21由本室保存。

　　2.酶：限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、T₄DNA连接酶均购自Promega公司。

　　3.组织标本：正常食管组织取自非正常死亡成人尸检标本。

　　4.实验动物：BALB/C小鼠，8～10周龄，由本所动物室供应。

　　二、方法

　　1.ECRG -1基因蛋白质编码区序列分析：根据ECRG-1的cDNA序列，在读码框架两侧设计引物，上游引物加BamHⅠ的酶切位点，下游引物加EcoR Ⅰ的酶切位点，所用引物序列：5′-TCGGGATCCAA-CATGATGTATCGGAGAGTA-3′；5′-TCGGAATTCGCTT-ATCTCCCCAGCTTACAA -3′。正常人食管组织在液氮下研磨，用Trizol试剂，按说明书提取总RNA，再逆转录成cDNA。用上述引物进行PCR扩增，循环参数为：94℃变性2 min后，94℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 30 s，35个循环，72℃延伸10 min。

　　2.DNA序列分析：PCR纯化产物和载体pT-Adv在16℃下过夜进行连接反应，取5μl连接产物转化TOP10F感受态细胞，筛选重组质粒送公司测序。

　　3.重组表达质粒的构建：重组质粒pT-Adv-ECRG1和表达质粒pGEX-4T-1分别用BamHⅠ和EcoR Ⅰ消化，用Advantage^TM PCR-Pure Kit纯化回收目的片段，目的片段与表达载体进行连接反应，取5μl连接物转化DH5α感受态细胞，重组表达质粒用EcoR Ⅰ和BamHⅠ酶切鉴定。

　　4.重组蛋白的诱导表达：重组表达质粒转化BL21感受态细胞，将携有ECRG-1片段重组表达质粒的大肠杆菌BL21过夜培养物，按1∶50接种在5 ml含有适量氨苄青霉素的luria-bertani培养基（LB培养基）中，37℃ 300 r/min振荡培养至A₆₀₀为0.4～0.6，加终浓度为1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷酶（ITPG）至LB培养基中，继续培养5 h。培养物离心、沉淀后，用SDS上样缓冲液悬浮，煮沸3 min。10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析。

　　5.Western blot：SDS-PAGE电泳后的凝胶，经电转仪将蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，一抗为抗谷胱苷肽巯基转移酶（GST）的多克隆抗体，二抗为辣根过氧化酶标记的抗羊IgG，显色检测。

　　6.多克隆抗体制备及纯化：从SDS-PAGE电泳凝胶上切下目的条带电洗脱，洗脱液加到TrisHCl中复性，PBS透析，离心去沉淀，蛋白定量。200μg蛋白与等体积福氏完全佐剂充分混匀，免疫BALB/C小鼠，2周后加强免疫1次，于加强免疫后7 d处死动物分离血清。以GST抗原与抗血清混合，吸附抗GST部分。直接酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定抗体效价。

　　7.直接ELISA测定抗体效价：以诱导表达的GST蛋白及融合蛋白分别包被酶标板，封闭后加倍比稀释的抗血清，以辣根过氧化酶标记的兔抗鼠IgG为二抗，经显色后测A₄₉₀。

　　结果

　　1.RT-PCR扩增ECRG-1基因的蛋白质编码序列：提取RNA经反转录后，PCR扩增出ECRG-1基因的蛋白质编码序列，PCR产物大小与预期的1200 bp相符(图1)。

a：pBR322/BstN I标准分子量；b:PCR产物图1　ECRG-1基因RT-PCR产物的琼脂糖电泳

　　2.蛋白质编码区DNA序列分析：PCR纯化产物连接到pT-Adv克隆载体上，转化大肠杆菌TOP10F，提取质粒DNA，用EcoRⅠ酶切电泳鉴定可见两条带大小分别为1.2 kb和3.9 kb。将该质粒送公司测序，结果与原序列一致。

　　3.重组表达质粒的构建及鉴定：以 BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ分别酶切pT-Adv-ECRG1和pGEX-4T-1，将目的片段插入到质粒pGEX-4T-1的 bamH Ⅰ和EcoR Ⅰ多克隆位点上，转化大肠杆菌DH5α，扩增后提取质粒，酶切鉴定。有插入片段的质粒命名为pGEX-4T-1-ECRG1（图2）。

a:pGEX-4T-1/EcoR Ⅰ酶切产物；b:pGEX-4T-1-ECRG1/EcoRⅠ酶切产物；c:λDNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ标准分子量；d:pGEX-4T-1-ECRG1/BamHⅠ+EcoR Ⅰ酶切产物；e:ECRG1基因PCR产物图2　pGEX-4T-1-ECRG1重组质粒酶切鉴定图谱

　　4.ECRG -1基因编码蛋白质的诱导表达与Western blot鉴定：将含有质粒pGEX-4T-1-ECRG1的大肠杆菌 BL21，以IPTG诱导表达，菌体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后可见相对分子质量为26000，71 000处各多出1条带。ECRG-1基因编码蛋白的相对分子质量为45000，质粒pGEX-4T-1表达的GST蛋白的相对分子质量为26 000，因此表达的GST-ECRG1融合蛋白为71000。用抗GST抗体，经Western blot检测， GST-ECRG1融合蛋白与GST蛋白条带位于上述分子量处，证明所表达蛋白的特异性(图3)。

a:GST蛋白；b:GST-ECRG1融合蛋白；c:蛋白分子量标准图3　融合蛋白的Western印迹分析

　　5.抗体制备及鉴定：BALB/C小鼠用融合蛋白GST-ECRG1免疫后，产生1∶3200滴度的抗血清。本研究所用抗原是融合蛋白，产生的抗血清中既有抗GST部分，又有抗ECRG-1部分。为了去除抗GST部分，我们用GST抗原中和抗GST部分。直接ELISA测定中和后的抗血清基本与GST不反应，而与ECRG-1保持较好的反应。

　　讨论

　　食管癌的发生发展与多种癌基因、抑癌基因改变有关^［4-7］，但尚未发现与食管癌有高度相关的基因。我们用mRNA差异显示技术获得了4个与食管癌发生相关的基因片段，获得了其中1个基因片段的全长 cDNA 序列（即ECRG-1）。该序列经Goldkey软件分析，具有一包含1176 bp的完整阅读框架，编码蛋白质包括392个氨基酸，蛋白相对分子质量为45000。经生物信息学方法分析，ECRG-1基因编码的蛋白质是丝氨酸蛋白酶家族中的一种蛋白。

　　应用RT-PCR对一些正常与肿瘤组织中ECRG-1基因进行分析，发现ECRG-1基因在几个正常组织文库中均有表达，而在一些肿瘤组织中无表达或低表达。由于mRNA翻译调控以及翻译后加工等因素，mRNA的表达水平并不能直接反映蛋白质的表达水平。蛋白质自身特有的活动规律，如蛋白质的修饰加工、转运定位、结构形成、代谢、蛋白质与蛋白质及其他生物大分子的相互作用等，均无法从基因水平上了解。因此，对蛋白质表达模式和功能的研究就成为克隆基因后的重要研究方向。也就是在一个更加深入、更加贴近生命本质的层次上，探讨和发现生命活动规律以及肿瘤发生发展的本质，为诊断与治疗肿瘤提供理论依据与新的途径。我们分离与食管癌相关基因的目的是要了解所分离出的基因的结构与功能，为食管癌的诊断及治疗提供理论与实验依据。为了获得ECRG-1基因编码的重组蛋白，我们选用简便、高效及生产成本低的原核表达系统。考虑到目的蛋白是未知的基因所编码的蛋白，我们选择融合蛋白表达载体，为后来的鉴定与分离纯化提供方便^［8］。

　　实验表明，外源基因ECRG-1在原核表达载体中能够表达GST融合蛋白。用SDS-PAGE电泳和Western blot方法显示，在装有外源基因表达载体的大肠杆菌中，与融合蛋白相应的蛋白分子量处有特异的蛋白条带，而GST蛋白处的蛋白条带消失。相反，在仅含空载体的大肠杆菌中，相对分子质量为26000处有GST蛋白的表达，间接地证明ECRG-1基因编码蛋白的表达。

　　用BALB/C小鼠制备抗血清，在较短的时间内获得所需多克隆抗体，这样可以缩短实验周期。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870837)；教委博士点资助项目作者单位：王越英（100021北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院病因与癌变研究室)

　　唐槐静（100021北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院病因与癌变研究室)

　　陆士新（100021北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院病因与癌变研究室)

　　王德斌（100021北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院病因与癌变研究室)

　　苏涛（100021北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院病因与癌变研究室)

　　刘海玲（100021北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院病因与癌变研究室)

　　谭文（100021北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院病因与癌变研究室)

　　王越英（100700 北京军区总医院肿瘤科）

　　参考文献

　　1．Miki Y, Swensen j, Shattuck-Eidens D,et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1. Science， 1994，266:66-71.

　　2．苏涛，刘海玲，陆士新，等. 人食管癌相关基因cDNA片段的克隆与初步鉴定.中华肿瘤杂志, 1998,20:254-257.

　　3．刘海玲, 张登学, 陆士新, 等. 5′RACE技术钓取未知基因中的应用.癌症, 1999,18:106-112.

　　4．梁苑苑, 陆士新. 食管癌癌变过程中c-myc 与HER-1癌基因表达的研究. 中华肿瘤杂志,1991,13:168-170.

　　5．郭永军, 陆士新,梁苑苑,等.原发性及亚硝胺诱导的食管癌中int-2基因的扩增.中华肿瘤杂志, 1993,15:91-93.

　　6．李华川, 陆士新. 食管癌组织中Rb基因突变与表达的研究.中华肿瘤杂志, 1993,15:412-414.

　　7．李华川, 陆士新. 食管癌组织中抑癌基因APC、MCC突变的研究.中华肿瘤杂志,1995,17:9-12.

　　8．Smith DB, Johnson KS. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene, 1988，67:31-40.