食管癌APC/MCC基因杂合缺失的研究
第三军医大学学报2000年第22卷第7期
王明荣 王海东 熊刚 房殿春
摘 要： 目的 研究APC/MCC基因杂合性缺失(LOH)与食管癌发生发展的关系。方法 应用多聚酶链反应技术及限制性片段长度多态现象对46例食管癌APC和MCC基因的LOH进行了分析。结果 食管癌APC和MCC基因LOH阳性表达分别为29.0%(9/31)和33.3%(8/24)。结论 APC、MCC基因的LOH是食管癌的常见改变，可能参与了食管癌的发生。
关键词：食管肿瘤；食管癌；抑癌基因；杂合缺失
研究发现，特定染色体区域的丢失在食管癌发生发展过程中起重要作用，染色体5q即是常见的丢失区域［1，2］。现已发现，在染色体5q21区域毗邻存在2个抑癌基因，即腺瘤性息肉病基因(APC基因)［3］和结肠癌突变基因(MCC基因)［4］。有关食管癌APC和MCC基因杂合缺失(Loss of heterozygosity,LOH)的研究国外已见报道，国内却鲜见报道。为探讨这些基因改变和食管癌发生发展的关系，我们采用聚合酶链反应技术(PCR)，并配合限制性片段长度多态现象(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析，对食管癌组织APC、MCC基因的杂合缺失进行研究。
1 材料与方法
1.1 标本收集和DNA提取 46例食管癌为我院1995年6月至1997年6月手术切除标本。手术切下肿瘤后立即收集癌组织和手术切缘处的正常粘膜组织，剔除出血、坏死部分，-80℃冻存备用。癌组织均经冰冻切片染色，镜检证实所测的癌组织癌细胞在50%以上，正常组织证实无癌细胞。采用蛋白酶K消化、酚/氯仿提取法抽提癌组织及正常组织DNA，用TE液稀释，于紫外分光光度计上测定其波长260 nm和280 nm处吸光度，计算DNA的浓度和纯度。
1.2 引物设计
根据文献［2］，针对APC和MCC基因合成了2对引物(引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成)，见表1。
表1 食管癌组织杂合缺失测定中使用的引物
tab 1 Primer for testing heterozygosity loss ofesophageal carcinoma
| Testing loci |
Enzyme |
Amplified segment
(bp) |
Sequence of primer |
| 11th exon of APC |
RsaI |
133/85＋48 |
5-GGACTACAGGCCATTGCAGAA-3 |
| |
|
|
5-GGCTACATCTCCAAAAGTCAA-3 |
| 10th exon of MCC |
|
93/79 |
5-TACGAATCCAATGCCACA-3 |
| |
|
|
5-CTGAAGTAGCTCCAAACA-3 |
1.3 PCR扩增 PCR反应总体积20 μl，其中模板DNA0.5 μg,Tris-HCl 10 mmol/L,KCl 50 mmol/L,MgCl 1.5 mmol/L,dATP、dCTP、dGTP各0.2 mmol/L，上游及下游引物各 20 pmol,Tap DNA多聚酶1.5 μl(华美生物工程公司)。在PCR扩增仪上(Perkin elmer Cetus 2400型)操作。反应条件：95 ℃变性 5 min后，94 ℃40 s，52或56℃ 40 s，72 ℃延伸60 s，循环35次，最后在72 ℃继续延伸 10 min。1.4 RFLP分析
APC第11外显子扩增产物用内切酶Rsal16U酶切12h，MCC扩增产物无需酶切，直接在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，溴乙锭染色，紫外光下观察电泳分离带并照像。
1.5 分析方法 正常组织DNA进行PCR扩增，APC第11外显子酶切和电泳分离后仅出现133bp条带为纯合子(非信息个体)，若出现133、85和48bp条带为杂合子(信息个体)。MCC第10外显子直接电泳分离后只出现93bp条带者为纯合子，出现93bp和79bp两条带者为杂合子。对信息个体癌组织DNA以同样的引物进行PCR-RFLP分析，比较同一病人癌组织及正常组织DNA条带及量的差异，就可以推算出是否存在LOH。
2 结果
2.1 食管癌组织APC和MCC基因的LOH 46例食管癌中，APC基因属信息个体者31例，检出LOH9例，占29.0%,见图1；MCC基因属信息个体者24例，检出LOH8例，占33.3%，见图2。将APC/MCC综合分析，属于信息个体者37例，检出LOH16例，占43.25。
2.2 LOH与临床病理参数的关系 根据食管癌组织学分类、肿瘤大小、有无浆膜浸润及淋巴结转移的不同类型进行分组，各组APC和MCC基因LOH情况见表2。经统计学处理，APC和MCC基因LOH阳性表达在各组间差异均不显著(P＞0.05)。
图1 食管癌组织APC基因的杂合缺失分析
n：正常组织；T：肿瘤组织
fig 1 Analysis of APC heterozygosity loss of the esophageal carcinoma
n：Normal tissue; T: Cancerous tissue
图2 食管癌组织MCC基因的杂合缺失分析
n：正常组织；T：肿瘤组织；2、3：杂合缺失
fig 2 Analysis of MCC heterozygosity loss of
the esophageal carcinoma
n:Normal tissue; T: Cancerous tissue; 2、3: Heterozygosity loss
表2 APC和MCC基因的杂合缺失与临床病理参数的关系
tab 2 Relationship between clinical pathological parameter and the heterozygosity loss of APC and MCC gene
| Clinical pathological parameter |
LOH/case |
| APC |
MCC |
| Histological type |
|
|
| Squamous cell carcinoma |
8/26 |
6/19 |
| Adenocarcinoma |
1/5 |
2/5 |
| Size of carcinoma |
|
|
| ＜3 cm |
5/17 |
5/17 |
| ＞3 cm |
4/14 |
3/7 |
| Penetrating muscle layer |
|
|
| Not penetrated |
6/19 |
5/15 |
| Penetrated |
3/12 |
3/9 |
| Lymph node metastasis |
|
|
| No metastasis |
4/12 |
4/10 |
| Metastasis |
5/19 |
5/14 |
3 讨论 食管癌发生的分子机制颇为复杂，涉及到多种癌基因的扩增与高表达，抑癌基因的突变和缺失及微卫星DNA不稳定性［1］。国外文献［1，2］报道食管癌APC和MCC基因有较高的LOH阳性表达，APC基因LOH阳性表达为38%～66%，MCC为63%。国内研究也发现，在人原发性食管癌中有一些标本存在APC和MCC的缺失和突变［5］。本研究对APC和MCC的LOH进行检测，APC和MCC基因的LOH阳性表达分别为29%和33.35%。若将APC/MCC综合分析，其LOH阳性表达为43.2%，说明APC/MCC基因LOH是食管癌的常见改变，可能参与了食管癌的发生和发展。APC和MCC基因均定位于染色体5q21，一般认为APC基因只有当一等位基因拷贝的LOH和另一拷贝的突充同时存在时才能使APC基因失活［6］。尽管多数食管癌存在APC基因LOH，但APC基因突变却很罕见，因此有作者认为APC基因LOH并不是食管癌发生的主要原因［7］。晚近Ogasawara等［1］检测食管癌组织染色体5q二核苷酸重复序列(微卫星)位点，结果发现多数食管癌存在5q部分或完全丢失，与APC基因位点不同，最常见的异变区域定位于5q31.1，提示此部位存在一食管癌的候选抑癌基因。因此，APC和MCC在食管癌发生发展中的确切作用尚需进一步研究。
多数作者认为，APC和MCC基因LOH是胃肠道肿瘤的早期改变，可能与肿瘤发生有关［8］。本文对APC和MCC基因LOH与临床病理参数的关系进行分析，并未发现以上基因LOH与食管癌组织学类型、肿瘤大小、浸润深度和淋巴结转移有显著相关关系。
癌是一种基因性疾病，这已被人们普遍接受。本研究表明，APC和MCC基因的LOH是食管癌发生、发展过程中较常见改变。通过对癌基因和抑癌基因的检测，不仅有助于我们从分子水平认识食管癌的发病机制，同时也可为食管癌的一级病因学预防提供分子生物学证据，有重要的理论和实践意义。
作者简介：王明荣(1950-)，男，江苏省南通市人，主任医师，教授，主要从事体外循环损伤、肺癌血管生长抑制治疗方面的研究，发表论文8篇。电话：(023)68754638王明荣（第三军医大学附属西南医院胸心外科，重庆400038)
王海东（第三军医大学附属西南医院胸心外科，重庆 400038)
熊刚（第三军医大学附属西南医院胸心外科，重庆 400038)
房殿春（第三军医大学附属西南医院胸心外科，重庆 400038）
参考文献
［1］ Ogasawara s, Tamura G, Maesawa G,et al. Common deleted region on the long arm of chromosome 5 in esophageal carcinoma［J］. Gastroenterology,1996,110(1):52-57.
［2］ Huang Y, Boynton R F, Blunt P L, et al. Loss of heterozygosity involves multiple tumor suppressor genes in human esophageal cancer［J］. cancer Res, 1992,52(47):6 525-6 530.
［3］ Greenwald B D, Harpaz N, Yin J, et al. Loss of heterozygosity affecting the p53, Rb and APC/MCC tumor suppressor gene loci in dysplastic and cancerous ulcerative colitis［J］. Cancer Res，1992，52(47):741-745.
［4］ Ashton-Rickardt P G, Wyllie A H, Bird C C, et al. MCC, candidate familial polyposis gene in 5q21, show frequent allele loss in colorectal and lung cancer［J］. Oncogene, 1991,6(10):1 881-1 886.
［5］ 李华川，陆士新.人原发食管癌组织中多种抑癌基因的研究［J］.中华医学杂志，1994，74(11)：489-491.
［6］ Aoki T, Mon T, Ciqun D, et al. Allelotype study of esophageal carcinoma［J］.Genes Chromosome Cancer, 1994,10(2):177-182.
［7］ Powell S M, Papadopoulos N, Kinaler K W, et al. APC gene mutations in the mutation cluster region are rare in esophageal cancer［J］. gastroenterology, 1994,107(6):1 759-1 763.
［8］ Tamura G, Macsawa C, Suzuki Y, et al. Primary gastric car-cinoma cell frequently lose heterozygosity at the genetic loci［J］. Jpn Cancer Res,1993,84(7):1 015-1 021.
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