γ-干扰素诱导大肠癌CCL229细胞表达LEA抗原的电镜研究

　　中国医科大学学报2000年第29卷第2期

周伟强　宋今丹

　　摘　要　目的：探讨γ-干扰素对人大肠癌细胞系肿瘤相关抗原 LEA表达的诱导作用。方法：将γ-干扰素与人大肠癌CCL229细胞共育培养，通过免疫铁蛋白电镜观察γ-干扰素对人大肠癌细胞系CCL229诱导作用的超微结构变化。结果：电镜观察发现，γ-干扰素诱导后，CCL229细胞表面皱褶增多，形成大量不规则突起，并且CCL229细胞针状伪足萎缩，微绒毛大多呈球状分布于胞体四周。结论：电镜超微结构的变化与γ-干扰素诱导后 LEA抗原表达量增加有关，并且γ-干扰素可能有抑制肿瘤细胞游走性、降低肿瘤细胞转移性的作用。

　　关键词：γ-干扰素　诱导作用　电镜

　　γ-干扰素作为一种可促进人主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex , MHC）抗原表达的细胞因子，通过上调MHCⅠ、Ⅱ类分子的表达进而影响肿瘤细胞相关抗原的表达。γ-干扰素对大肠癌细胞超微结构的变化，国内外文献未见报道。本文通过γ-干扰素诱导下人大肠癌细胞系CCL229电镜超微结构的变化来说明γ-干扰素诱导作用的本质，为将γ-干扰素用于大肠癌肿瘤疫苗的制备及基因治疗提供重要的实验依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞系

　　人大肠癌CCL229细胞由美国哈佛大学医学院Dana-Farber肿瘤研究所惠赠，复苏后于含10%小牛血清的DMEM培养液中，在5% CO₂、100%湿度、37℃条件下培养，取对数生长期细胞进行实验研究。

　　1.2　试剂

　　γ-干扰素，北京邦定生物医学公司1996年产品(100万u/ml)，纯度99%；戊二醛，北京华美生物制品公司1997年产品；锇酸，美国Serva公司1997年产品。

　　1.3　γ-干扰素诱导大肠癌CCL229细胞表达LEA抗原的电镜研究

　　1.3.1　常规扫描电镜观察：将CCL229细胞盖玻片培养，γ-干扰素以500 u/ml的作用浓度与CCL229细胞共育培养24 h，以 PBS作对照。培养相应时间后，取出盖玻片戊二醛—锇酸双重固定，系列脱水，临界点干燥，金属镀膜后于S450扫描电镜下观察。

　　1.3.2　免疫铁蛋白电镜观察：将γ-干扰素诱导的CCL229细胞经2.5%戊二醛原位固定后，刮取细胞， 1 000 r/min离心10 min，使其形成细胞团块。细胞团在4%甲醛溶液内，0℃固定2 h，并用四氧化锇后固定2 h。将细胞团浸于ND-1单克隆抗体液中，室温作用30～60 min。以大量冷缓冲液充分洗涤3次，每次30 min。然后浸入铁蛋白标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体液中（制备方法详见文献^［1］），室温作用30 min。充分洗涤后，捞取细胞团。四氧化锇固定30 min。常规系列乙醇—丙酮脱水，Epon 812树脂包埋，LKB超薄切片，醋酸铀－柠檬酸铅复染，H 600透射电镜观察。

　　2　结果

　　2.1　扫描电镜下观察结果

　　未经γ-干扰素诱导的CCL229细胞多呈梭形生长，铺展状况良好，细胞表面不光滑，放射状分布大量微绒毛，梭形尖端伸出许多针状伪足，呈网状排列(图1)。而经γ-干扰素诱导的 CCL229细胞形态不一，有的呈梭形，有的为圆形或椭圆形。细胞表面皱褶较多，形成大量不规则突起，针状伪足不如γ-干扰素诱导前的发达，大多萎缩。而微绒毛则呈球状分布于胞体四周（图2）。

图1　未经γ-干扰素诱导的CCL229细胞多呈梭形生长，铺展状况良好，梭形尖端伸出许多针状伪足，呈网状排列　SEM ×2 700

　　Figure 1　Under scanning electron microscope, more CCL229 cells assumed the shuttle shape to grow without interferon-γ, the spreading out condition was good,

　　and the pointed end stretched out many needle pseudopodium, assumed

　　the net form range.　SEM ×2 700

图2　经γ-干扰素诱导的CCL229细胞表面皱褶较多，形成许多不规则突起，针状伪足多萎缩　SEM ×2 200

　　Figure 2　With interferon-γ inducing, the surperficial fold of cells formed more rumples and irregular protuberances,

　　and needle pseudo-podium mostly withered　SEM ×2 200

　　2.2　铁蛋白标记抗体免疫电镜观察结果

　　经γ-干扰素诱导的CCL229细胞表面有许多不规则的绒毛状突起，在突起与凹陷部位可观察到铁蛋白颗粒，其大小均匀，反差强，不难与其它细胞颗粒成分区分。而在细胞内部未发现铁蛋白颗粒，说明铁蛋白标记抗体没能穿透细胞膜进入胞内（图3）。

图3　经γ-干扰素诱导的CCL229细胞表面可观察到大量铁蛋白颗粒，大小均匀，反差强　×12 000

　　figure 3　With interferon-γ inducing,the CCL229 cells' surface can be observed many ferritin granules whose dimension was even and the contrast was strong, and would not hard to distinguish with other　×12 000

　　3　讨论

　　常规扫描电镜下观察到γ-干扰素诱导的CCL229细胞形态不一，细胞表面皱褶较多，形成许多不规则突起。这些突起的性质尚不清楚，估计是由于γ-干扰素诱导使CCL229细胞膜折叠作用加强，膜表面积增大，使原本存在于细胞内部的抗原决定簇暴露在细胞膜表面，而使膜抗原LEA的表达量增加。针状伪足经γ-干扰素诱导后大多萎缩，而微绒毛也缩为球状分布于胞体四周。目前普遍认为，肿瘤细胞的伪足、微绒毛与侵袭力密切相关。恶性肿瘤细胞在侵袭过程中，首先伸出伪足再定向运动至靶部位，并与靶部位基膜接触、粘附，进而释放各种降解酶类破坏基膜成分而逐渐定位^［2］。因此，γ-干扰素可能通过降低肿瘤细胞的游动性，影响其侵袭力而使肿瘤细胞转移性降低。

　　周伟强(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)

　　宋今丹(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)

　　参考文献

　　1，周伟强，宋今丹. 铁蛋白标记抗体的制备及其在免疫电镜中的应用. 中国医科大学学报，1999,28(4)：256～260

　　2，孙宝栋，宋今丹.不同人大肠癌细胞的体外侵袭力及相关生物学特性的比较研究.细胞生物学杂志,1996,18(4):185～187