人大肠癌细胞株的转移潜能及其相关特性的比较

世界华人消化杂志 1998年第1期第6卷 研究原著

作者：邓永键 李祖国 邱红明 黄卓垣 丁彦青 朱梅刚

单位：第一军医大学病理学教研室 广东省广州市 510515

　　Comparison of metastatic potentials of human colorectal carcinoma cell lines

　　and their features related to metastasis

　　Deng YJ, Li ZG, Qiu HM, Huang ZY, Ding YQ, zhu MG

　　Comparison of metastatic potentials of human colorectal carcinoma

　　cell lines and their features related to metastasis

　　dENG Yong-Jian, LI Zu-Guo, QIU Hong-Ming, HUANG Zhuo-Yuan,

　　dING Yan-Qing and ZHU Mei-Gang

　　department of Pathology, First Military Medical University, Guangzhou

　　510515, Guangdong Province, China

　　Subject headings colonic neoplasms/pathology; rectal neoplasms/

　　pathology; neoplasm metastasis/pathology; tumor cells, cultured

　　Abstract

　　AIM To compare the metastatic potentials between two human colorectal

　　carcinoma cell lines and to study their features related to metastasis.

　　mETHODS Experimental metastatic potentials of two human colorectal

　　carcinoma (HCC) cell lines, HT29 and LoVo, were compared by using nude

　　mice model of HCC liver metastasis. The expressions of E-cadherin, LNR

　　and type Ⅳ collagenase (Ⅳ col) of these HCC cell lines in vitro were

　　observed quantitatively. The cells expressing CD44V6 in mRNA and protein

　　were detected by in vitro hybridization and immunohistochemistry.

　　rESULTS The nude mice had 100% liver metastasis which demonstrated

　　that LoVo is a high metastatic HCC cell line. However, HT29 is a relatively

　　low metastatic HCC cell line since only 42.9% of nude mice transplanted HT29

　　cells had liver metastasis. The expressions of E-cad, LNR and Ⅳ col of HT29

　　and LoVo cells in vitro were detected quantitatively which showed that HT29

　　cells had weak E-cadherin expression on cell membrane while LoVo cells

　　showed almost no expression. The expressions of LNR and Ⅳ col in LoVo

　　cells both were higher than that in HT29 cells. The expressions of CD44V6

　　of LoVo cells were higher than that of HT29 cells in either mRNA or protein.

　　cONCLUSION LoVo is a high metastatic HCC cell line, while HT29 is a

　　relatively low metastatic HCC cell line. E-cadherin, LNR, Ⅳ col and CD44V6

　　can be used to determine the metastatic potential of HCC cells.

　　主题词 结肠肿瘤/病理学；直肠肿瘤/病理学；肿瘤转移/病理学；肿瘤细胞，培养的

　　中国图书资料分类号 R 735.34

　　摘 要目的 比较两种人大肠癌细胞株的转移潜能及其相关性.

　　方法 利用裸鼠实验性肝转移模型比较人大肠癌HT29与LoVo细胞株的转移潜能；定量检测两种细胞株层粘连蛋白受体(LNR)、上皮性钙调蛋白(E-cad)及Ⅳ型胶原酶的表达；用原位分子杂交及免疫组化检测两细胞株CD44V6在蛋白质水平及mRNA水平的表达。

　　结果 LoVo细胞株为人大肠癌高转移株，裸鼠实验性肝转移率为100%；HT29细胞株转移相对较低，裸鼠肝内转移率为42.9%. 定量检测发现，LoVo细胞几乎不表达

　　e-cad，HT29细胞膜上弱表达E-cad. LoVo表达LNR与Ⅳ型胶原酶高于HT29. LoVo细胞内CD44V6的表达在蛋白质水平与mRNA水平均高于HT29细胞.

　　结论 LoVo细胞株为人大肠癌高转移株，HT29细胞株转移力相对较低；LNR、

　　e-cad、Ⅳ型胶原酶及CD44V6可作为大肠癌细胞转移潜能的相关指标。

　　0 引言

　　研究表明，大肠癌的转移与细胞高表达Ⅳ胶原酶、层粘连蛋白受体(laminin

　　receptor, LNR)有关，细胞与细胞之间的粘附分子上皮性钙调蛋白(epithlial cadherin,

　　e-cad)与细胞的粘附、游走、浸润以及细胞与基底膜之间的信使传递有关^［1］。

　　cD44V6的表达也与大肠癌的转移特性相关联^［2］.我们选用人大肠癌HT29和LoVo细胞株，利用大肠癌裸鼠肝转移模型比较二细胞株的转移潜能，并且检测CD44V6,

　　lNR，E-cad及Ⅳ胶原酶，在二细胞株中的表达.探讨不同转移潜能的人大肠癌细胞株与其相关分子表达的相互关系，为大肠癌的实验性治疗，临床预后判断及抗大肠癌转移药物的筛选提供参考指标。

　　1 材料和方法

　　1.1 HT29与LoVo细胞株裸鼠体内转移的潜能 人大肠癌细胞株HT29和LoVo均引自美国，本教研室自存，常规培养. 细胞接种：BALB/c裸小鼠由中山医科大学实验动物中心提供，6周龄，体重18 g～22 g，雌性，SPF条件下饲养.采用Giavizzi et al^［7］介绍的方法并做改良接种细胞.于裸鼠脾脏内接种0.3 ml含10⁶细胞. hT29细胞接种裸鼠7只，LoVo细胞接种12只.待裸鼠出现腹水或濒死状态时处死动物，肉眼及显微镜下观察转移结节的形成。

　　1.2 细胞LNR、E-cad及Ⅳ型胶原酶的表达的检测 细胞培养于盖玻片条上至半汇合状态终止培养，第一抗分别为LNR(北京医科大学病理教研室)单抗、E-cad(SIGMA)单抗、Mr 72 000 Ⅳ型胶原酶多抗(美国NIH的William G Stetler-Stevenson教授惠赠). FITC标记的二抗(北京中山公司)标记细胞.激光扫描共聚焦显微镜

　　aCAS570(Meridian Instrument, Inc.)检测被荧光标记物在细胞内的分布，并对细胞内被检测的物质进行定量分析和统计比较。

　　1.3 细胞株CD44V6表达的检测 ①蛋白质水平的检测：细胞培养于盖玻片条上至半汇合状态终止培养，取出，PBS漂洗1 min×3，950 ml/L乙醇固定3min，PBS漂洗1 min×3. 用LSAB真空负压法免疫染色标记CD44V6(R&D公司).②mRNA水平的检测：采用地高辛标记探针检测CD44V6，序列为：5′-TGAGATTGGGTTGAAGA aATC-3′(上海细胞生物所赛尔公司)，DIG oligonucleotide Tailing Kit (BOEHRINGER)标记。

　　细胞培养于盖玻片条上至半汇合状态终止培养，取出，PBS漂洗1 min×3；甲醇：丙酮(1∶1)固定10min；10 mg/L蛋白酶K消化，37℃，10min；100 ml/L 多聚甲醛后固定10min. 用已标记地高辛的CD44V6寡核苷酸探针进行杂交，用阳性计分法^［8］在显微镜下随机计数300个细胞，用(-)、(+)、(++)、(+++)表示细胞内mRNA表达强度. 细胞mRNA表达计分=(+)%×１+(++)%×2+(+++)%×3。

　　2 结果

　　2.1 HT29与LoVo细胞株经脾接种裸鼠肝内转移情况及形态观察 细胞株接种于裸鼠脾内30 d后，部分动物有明显腹水及接近死亡，剖杀动物。结果表1。

　　接种HT29与LoVo细胞的裸鼠脾移殖瘤与肝转移瘤组织学形态无明显差别。

　　χ²检验两细胞株肝转移率有显著差别(^aP＜0.05)，可见LoVo为人大肠癌高转移细胞株，HT29转移力相对较低。

　　2.2 E-cad，LNR及Ⅳ型胶原酶在细胞中的表达 HT29细胞E-cad染色为阳性，分布于细胞膜上；LoVo细胞未见明显表达E-cad，激光扫描共聚焦显微镜检测仅见不规则的细散小点，不能进行定量分析. LoVo细胞较高表达LNR，LNR阳性信号主要位于细胞膜上，胞浆内与细胞核周边也可见着色(图1)；HT29细胞仅少部分细胞有

　　lNR表达，LoVo细胞表达LNR高于HT29细胞(P＜0.05)HT29与LoVo细胞浆内见广泛高亮度Ⅳ型胶原酶显色，定量检测Ⅳ型胶原酶表达在细胞近似于正态分布(图2)，LoVo表达高于HT29细胞(P＜0.05)。

　　表1 HT29与LoVo细胞株经脾接种肝内转移情况比较

　　^aP＜0.05，χ²=8.685.

　　图1 LoVo细胞层粘连蛋白受体表达扫描图，激光扫描共聚焦显微镜×400

　　图2 定量分析HT29与LoVo细胞内Ⅳ型胶原酶表达近似正态分布，二者峰值分离表明有显著差别(绿色为HT29细胞，红色为LoVo细胞)。

　　图3 HT29细胞CD44V6 mRNA染色见浆内较稀疏的蓝色信号颗粒，HT29细胞mRNA信号表达强弱较一致。

　　图4 LoVo细胞CD44V6 mRNA染色胞浆内见致密的蓝色信号颗粒，分布较弥漫，部分细胞信号表达明显增强。

　　2.3 细胞株CD44V6表达 ①mRNA水平：原位分子杂交实验结果显示：HT29，LoVo两种细胞系均有CD44V6mRNA阳性信号表达. HT29细胞浆内均见有较稀疏的蓝色信号颗粒，HT29细胞mRNA信号表达强弱较一致(图3). LoVo细胞胞浆内见致密的蓝色信号颗粒，分布较弥漫，部分细胞信号表达明显增强(图4). HT29细胞CD44V6 mRNA表达量低于LoVo细胞，两者阳性表达的积分比为HT29：LoVo=1.03∶2.56.②蛋白水平：免疫组化结果示两细胞株均表达CD44V6蛋白. HT29细胞主要在细胞膜上表达，表达强度较一致. LoVo细胞表达强度不一致，较幼稚的细胞强阳性表达，而且胞浆内亦有表达，部分细胞则低表达。

　　3 讨论

　　将大肠癌细胞注入到裸鼠脾脏或门静脉内，在裸鼠肝内出现转移瘤，称为大肠癌的实验性肝转移. 实验性肝转移操作简便，需时短(约4 wk)，转移瘤形成率高，可作为大肠癌细胞株转移潜能的比较、高转移细胞株的筛选及抗大肠癌转移药物的筛选与疗效观察. 我们选用人大肠癌的实验性肝转移模型来比较HT29与LoVo细胞株的转移潜能，二者的肝转移率分别为42.9%(3/7)与100%(12/12)，说明LoVo细胞株为高转移株，HT29细胞株转移力相对较低。

　　肿瘤的高转移特性与瘤细胞分泌蛋白溶解酶增多、细胞与细胞的粘附降低及细胞的游走性增强有关^［1］. E-cad、LNR、CD44均为细胞粘附分子，均为跨膜蛋白。

　　e-cad参与上皮细胞与细胞间的连接，与肿瘤的生长、分化与转移有关，E-cad在大肠癌中的不同程度的表达降低或缺失与大肠癌的浸润与转移相关^［1,3］。LNR是一种跨膜受体，它与基底膜中的配体Laminin相结合，介导一系列生物学效应.人肺巨细胞癌PG细胞系是一高转移细胞系，其细胞表面高表达LNR并能影响与转移相关的生物学特性^［1，4］.

　　CD44是一个细胞跨膜糖蛋白粘附分子，人类CD44基因位于第11号染色体短臂上，是一种单拷贝基因，至少由20个外显子组合而成，其中有10个外显子为组成型外显子，另外10个为变异拼接型外显子(V1～V10),它们位于第5和第6个组成型外显子之间. 10个变异拼接型外显子的表达方式十分特殊^［5］，它可以以单个的形式插入组成型外显子中表达，也可以以不同的组合方式甚至不同的顺序插入组成型外显子中来表达. 仅由组成型外显子编码的蛋白质称CD44标准体(CD44 standard, cD44s)，组成型外显子中插入不同变异拼接型外显子所编码的蛋白质称为CD44变异体(CD44

　　variant, CD44v). CD44s通过胞质内区的羧基端色氨酸磷酸化调节作用，能影响细胞骨架蛋白的分布，影响细胞的迁移和运动.这可能与肿瘤的浸润和转移有关。

　　cD44V6在许多恶性肿瘤中表达增强^{［２，６，７］}，在人正常的结肠粘膜组织中不表达^［8］，因此，它的过表达被认为是大肠癌和其他一些肿瘤转移的标志之一.Ⅳ型胶原酶(Mr 72 000)是近年研究得较多的蛋白水解酶，在浸润性肿瘤中的高表达是浸润表型的重要物质基础.

　　LoVo细胞株高表达LNR，Ⅳ型胶原酶及CD44V6，低表达E-cad，这些与LoVo细胞株的高转移特性相一致. 并且由于CD44V6在大肠癌细胞株中蛋白水平与mRNA水平均表达，说明CD44分子在转录水平出现调控紊乱.相应地，由于较低转移细胞株HT29细胞低表达LNR、Ⅳ型胶原酶与CD44V6，较高表达E-cad.因此，这些结果提示：不同转移潜能的人大肠癌LoVo与HT29细胞株可作为大肠癌转移机制的研究，E-cad，

　　lNR，CD44V6及Ⅳ型胶原酶有可能既作为大肠癌转移特性及临床预后判断的相关指标，又可作为抗大肠癌转移药物对基因调控的监测。

　　邓永键，男，1969-06-15生，湖南省邵东县人，汉族. 1993年第一军医大学临床医学六年制本科毕业，1996年获医学硕士学位，助教，主要从事大肠癌转移的研究与病理学教学工作，发表论文3篇.

　　通讯作者 邓永键，510515，广东省广州市第一军医大学病理学教研室.

　　Correspondence to: DENG Yong-Jian, department of Pathology, First

　　military Medical University, Guangzhou 510515, China

　　tel. +86·20·87705370-48490

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　　收稿日期 1997-09-02