大肠癌患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性的检测及其临床意义

中国普外基础与临床杂志 1999年第5期第6卷 临床研究

作者：王金穗

单位：甘肃省人民医院病理科(兰州　730000)

　　关键词： 脱氧核糖核酸核蛋白体；转录活性；嗜银蛋白；图像分析；大肠癌

　　摘要　为探讨脱氧核糖核酸核蛋白体(rDNA)转录活性在大肠癌的诊断和鉴别诊断、治疗效果及预后判断的意义，通过细胞培养及银染方法，应用CMIAS-008图像分析系统，对59例大肠癌、20例大肠炎性疾病患者及9例健康者的外周血T淋巴细胞rDNA转录活性进行了检测(以核仁组成区嗜银蛋白银染强度来表达)。结果：大肠癌患者rDNA转录活性明显降低，而在大肠炎性疾病组明显升高，分别与正常对照组比较，差异均有显著性意义(P＜0.01)； 大肠癌手术及化疗后，T淋巴细胞rDNA转录活性则逐渐升高并接近正常对照组，术后3年内肿瘤复发者该指标则又逐渐下降。结论： T淋巴细胞rDNA转录活性的检测可作为大肠癌与大肠炎性疾病的鉴别指标，同时可作为疗效及监测肿瘤复发的参考指标。

THE DETECTION OF T-LYMPHOCYTES rDNA TRANSCRIPTION ACTIVITY IN PERIPHERAL BLOOD AND CLINICAL SIGNIFICANCE FOR COLORECTAL CARCINOMA PATIENT

Wang Jinsui. Department of Pathology, The People′s Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000

　　Abstract　To study the significance of T-lymphocytes rDNA transcription activity in diagnosis, differential diagnosis, therapeutical effect and evaluation of treatment for colorectal carcinoma, 59 cases of colorectal carcinoma, 20 cases of colorectal inflammatory disease and 9 volunteers were choosen to detect the T-lymphocyte rDNA transcription activity of peripheral blood T-lymphocyte by cell culture and CMIAS-008 image analysis system of Ag-NOR. Results: T-lymphocytes rDNA transcription activity was decreased obviously in colorectal inflammatory patients. Compared with control group, both group showed markedly statistical difference (P＜0.01). T-lymphocytes rDNA transcription activity increased gradually to normal groups after operation and chemical treatment for colorectal carcinoma patients; but it decreased for recurrent patients three years after operation. Conclusions: The detection of T-lymphocytes transcription activity can be used as a differential criterion for colorectal carcinoma and colorectal inflammatory disease, meanwhile it also can be used as a reference criterion for evaluation of treatment and supervision of tumor recurrence.

　　Key words　　Deoxyribonucleic acid ribosome　　Transcription activity　　Ag-NOR　　Image analysis　　Colorectal carcinoma

　　核仁组成区相关的嗜银蛋白(Ag-NOR)的银染程度被公认为是反映细胞中核糖核酸蛋白体(rDNA)转录活性及蛋白质合成水平的重要标志，并已证实该银染部分是具有生物活性并可进行正常转录的rDNA区域周围的酸性非组蛋白^〔1〕，其羧基即为银离子的结合位点。这种酸性非组蛋白直接或间接参与染色体的构建，启动基因的复制，调节rDNA基因的转录。因此，其银染蛋白的含量和分布特征表明了该细胞中rDNA转录活性的强弱^〔2〕。细胞核仁的银染面积和银染积分光密度是检测细胞rDNA转录活性的敏感指标^〔3〕。本实验通过CMIAS-008图像分析系统，对大肠癌患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性进行了检测，旨在探讨rDNA转录活性在大肠癌的诊断和评估预后的临床意义。

　　1　对象和方法

　　1.1　研究对象及分组

　　选取我院肛肠科1998年7月至1999年3月手术并经病理组织学证实的结直肠癌患者59例，其中为术前者24例(术前组)，术后0.5～3年内肿瘤复发者12例(复发组)，结直肠癌术后行1个疗程常规化疗者11例(化疗组)，术后0.5～3年内无肿瘤复发者12例(无复发组)。同时选择同期收治的结直肠各种炎性疾病患者20例(包括大肠及肛门急、慢性炎症，如结肠炎、结肠粘膜下脓肿、肛周脓肿及肛瘘等，所有病例均经肠镜及病理活检为诊断依据)作为病例对照组，以及选取健康体检者9例作为正常对照组。

　　1.2　主要试剂和仪器

　　1.2.1　仪器　采用CMIAS-008型多功能真彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学图像中心研制)，由生物显微镜、高分辨彩色摄像机、高分辨彩色监视器和计算机图像处理系统(包括真彩色实时图像采集卡及含有rDNA分析模块的图像分析软件)组成。

　　1.2.2　试剂　细胞培养液及终止液(由北京中山生物技术有限公司提供，单人份加有肝素包装，5 ml/人份)； 银染液为50% AgNO3水溶液及1%甲酸+2%明胶水溶液； 细胞固定液为甲醇∶冰醋酸＝3∶1(临用时配制)； 低渗液为0.075 mmol/L KCl。

　　1.3　方法

　　1.3.1　培养　所有病例抽取空腹外周静脉血0.5 ml，注入盛有培养液的瓶中，置37℃恒温箱中孵育至70小时，加入终止液1滴，再过2小时后取出备检。

　　1.3.2　制片　取出已培养好的标本，用吸管将其轻轻混匀吸出，注入离心管中，1 500 r/min离心10分钟，弃上清液留底物，加入已预热成37℃的低渗液5 ml并混匀，置37℃恒温箱内20分钟后取出，直接加细胞固定液0.5 ml，再离心(1 500 r/min)10分钟，弃上清液留底物，加入细胞固定液5 ml并混匀，室温静置10分钟后离心(1 500 r/min)10分钟，弃上清留底物，加入3～5滴细胞固定液混匀。吸出混匀液，直接滴在于4℃预冷的玻片上(玻片距滴管高度约30 cm)，防尘自然干燥。

　　1.3.3　染色　将制备好的滴片加染液50% AgNO₃ 3滴及1%甲酸+2%明胶水溶液3滴，用盖玻片覆盖染液表面，放入80℃水浴恒温箱中，待滴片颜色变至棕黄色时即可终止染色，然后去盖玻片，立即用蒸馏水冲洗，室温晾干，直接镜检。

　　1.3.4　分析　将染好的滴片置于CMIAS-008型多功能真彩色病理图像分析系统的显微镜载物台上，用40倍物镜观察，找到被银染的淋巴细胞核并使其位于监视器的测量区域内，依次选择10个银染的T淋巴细胞，由计算机自动完成图像处理并测出淋巴细胞核仁银染强度的平均值，以核仁银染面积(S_核仁)与细胞核面积(S_核)的比值及银染核仁积分光密度(IOD_核仁)与细胞核积分光密度(IOD_核)的比值两项指标来表示^〔2〕。1.4　统计学处理

　　实验所测得的各组数据以±s表示，并用q检验和方差分析。

　　2　结果

　　各组外周血T淋巴细胞图像分析测定结果见附表。由附表可见，外周血T淋巴细胞Ag-NOR的银染强度，大肠癌术前组及复发组较正常对照组及其他各组均显著降低(P＜0.01)； 病例对照组则较正常对照组及其他各组均显著升高(P＜0.01)； 大肠癌化疗组及无复发组的水平则接近正常对照组(P＞0.05)。

附表　各组外周血T淋巴细胞Ag-NOR银染强度测定结果(±s)

　　与正常对照组、化疗组及无复发组比较，*P＜0.01； 与其他各组比较， △P＜0.013　讨论

　　一般认为，癌细胞具有与正常细胞不同的抗原物质，这种抗原物质能使巨噬细胞致敏，使其首先作为癌灶局部的免疫活性细胞参与机体的抗癌反应； 同时通过浓集、处理、储存抗原，将抗原信息传递给淋巴细胞，并调节淋巴细胞的免疫反应^〔4〕。T淋巴细胞是细胞免疫的主体细胞，他们的生物活性可直接反映机体的免疫状况。在癌的发展过程中，癌细胞能产生某些特异的免疫抑制因子如甲胎蛋白(AFP)、免疫抑制酸性蛋白(IAP)等，使机体逐渐陷入免疫功能低下状态，淋巴细胞生物活性降低，淋巴细胞核仁银染强度亦明显下降^〔2〕。国内外有关肿瘤细胞核仁Ag-NOR研究的文献均表明，在常规石蜡包埋的切片中，肿瘤细胞核仁的Ag-NOR颗粒的大小和数量，恶性肿瘤比良性肿瘤大而多，分化低的肿瘤比分化高的肿瘤也明显大而多^〔5，6〕，这与肿瘤细胞增殖失控的特性是相吻合的，肿瘤细胞Ag-NOR的这种变化为肿瘤的定量研究提供了物质基础^〔7〕。本实验结果显示，大肠癌经手术及化疗后，癌细胞的绝对数量大大减少，其对机体免疫系统的抑制作用减弱，T淋巴细胞rDNA转录活性又可逐渐恢复并接近正常水平。这对大肠肿瘤的诊断与鉴别诊断以及术后复发的判定具有重要的临床意义。病例对照组T淋巴细胞Ag-NOR银染强度明显高于其他各组，说明炎症时淋巴细胞rDNA转录活性增高，这与临床所见的炎症患者白细胞数量增加是吻合的，反映了机体免疫系统对病原微生物的防御机能。

　　不同种类的大肠疾病患者，其外周血T淋巴细胞核仁组成区嗜银蛋白的银染强度不同，表明其rDNA转录活性有所不同，其中大肠癌表现为明显降低，但经手术及化疗后可逐渐升高，若肿瘤有复发则又下降； 大肠炎性疾病则表现为明显升高。因此，检测外周血T淋巴细胞rDNA转录活性可作为大肠癌的诊断以及评估治疗效果及监测术后癌复发的参考指标。

　　参考文献

　　1　Anonomyous. NORs-a new method for the pathologist. Lancet, 1987; I(8547)∶1413

　　2　陈立奇， 何其华， 刘　卉等. 带腹水癌肉瘤S-180小鼠的骨髓淋巴细胞rDNA转录活性变化的研究. 动物学报， 1994； 40(2)∶218

　　3　陈立奇， 何其华， 王戈华等. 对rDNA转录活性的图像分析. 遗传学报， 1990； 17(1)∶75

　　4　朱梅刚， 周志韶. 淋巴组织增生性疾病病理学. 第1版. 广州： 广东高等教育出版社， 1994∶13～14

　　5　Crocker J , Paramjit Nar. Nucleolar organizer regions in lymphomas. J Pathol, 1987; 151(2)∶111

　　6　Crocker J, Skilbeck N. Nuleolar orgniser region associated proteins in cutaneous melanotic lesions: a quantitative study. J Clin Pathol, 1987; 40(8)∶885

　　7　王瑞年， 胡丹毅. Ag-NOR肿瘤研究的一项新指标. 国外医学肿瘤学分册， 1989； 16(1)∶22

(1999-05-20收稿，1999-07-15修回)