应用逆转录聚合酶链反应技术检测大肠癌微转移及其临床意义

中国实用外科杂志 2000年第10期第20卷 讲座与综述

作者：林国乐　邱辉忠

单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院外科100730

　　大肠癌的转移和复发是影响病人预后的重要因素，而肿瘤细胞在淋巴结、外周血、骨髓和腹腔中的微转移则是导致转移和复发的主要原因。因此，及时发现微转移不仅对大肠癌复发和预后的判断有重要意义，而且对指导临床治疗亦有重要价值。由于微转移的肿瘤细胞数较少，现有的病理形态学及免疫细胞化学技术很难取得理想的检测结果。近年来，由于逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)技术的应用，大大提高了肿瘤微转移检测的敏感性和特异性^［1］。本文就RT－PCR技术检测大肠癌微转移的研究近况作一综述。

　　1　原理和方法

　　1.1　靶RNA的选择

　　RT－PCR检测肿瘤细胞的基本原理是通过扩增出肿瘤细胞“标志性”靶RNA来证实肿瘤细胞的存在。因此，选择适当的靶RNA是决定检测结果是否准确可靠的重要因素。作为肿瘤细胞“标志”的靶RNA大致包括两类：(1)肿瘤特异性RNA，即该mRNA的表达为某种肿瘤细胞所特有，并且几乎所有的这种肿瘤细胞均有表达，而其它组织细胞不表达。(2)组织特异性RNA，即为某种肿瘤起源组织所特有的mRNA，而正常循环血或骨髓中的细胞不表达这种mRNA。目前，临床上作为检测大肠癌微转移的靶RNA主要有三种：(1)癌胚抗原(CEA)mRNA。(2)CD44剪接变异体(CD44v)mRNA。(3)细胞角蛋白(cytokeratin,CK)mRNA。前二者被视为肿瘤特异性RNA；而后者为组织特异性RNA，仅在上皮来源的组织或细胞中表达。

　　1.2　敏感性和特异性

　　RT－PCR检测肿瘤细胞敏感性高。国外学者研究表明，采用CK20(或CK19)mRNA RT－PCR法可以在1mL全血中检出一个上皮来源的肿瘤细胞^［2、3］。显然RT－PCR技术具有细胞形态学、免疫细胞化学技术不可比拟的敏感性，因而尤其适于微量肿瘤细胞的检测。RT－PCR的特异性是由其扩增引物的高度选择性决定的。但就检测结果而言，其特异性主要由靶RNA所决定。以肿瘤特异性RNA作为肿瘤“标志”，检测结果的特异性毋庸置疑。而以组织特异性RNA(各CK mRNA)作为靶RNA，其特异性有所差异。Burchill等^［4］对包括结肠癌在内的一系列细胞株进行检测发现，CK8、CK19在正常外周血中均有较高的阳性率，分别为88%、40%；而CK20仅在结肠癌细胞中表达，正常外周血细胞为阴性。可见，CK20 mRNA具有严格的上皮组织特异性，满足高灵敏的RT－PCR法对靶RNA的特殊要求，可以作为大肠癌病人外周血、骨髓以及淋巴结中癌细胞存在的标志。

　　1.3　对照设计及检测方法

　　设计合理的对照对判定RT－PCR检测结果具有重要参考价值。目前RT－PCR的对照包括以下方面：(1)内参对照，即为验证所提取的RNA是否完整，合成的cDNA是否充足而设立的对照。一般是通过设计一对特异性引物来扩增组织细胞中普遍存在、含量相对稳定的看家基因的cDNA序列，如β₂－微球蛋白(β₂－microglobulin)^［5］、GAPDH^［6］等，以此作为内参对照。(2)阳性对照和阴性对照，一般以表达靶RNA的肿瘤细胞株作为阳性对照，而以不表达靶RNA的其它肿瘤细胞株或不加入模板RNA作为阴性对照。检测的基本程序如下：(1)收集待检标本，-80℃保存备用。(2)以酸性硫氰酸胍－酚－氯仿法或其它方法提取RNA，-80℃贮存待检。(3)逆转录合成cDNA。(4)PCR反应，RT－PCR也可以一步完成，但目前许多学者为提高扩增效率和特异性，多采用套式引物PCR反应技术。(5)电泳，染色，结果判定^［1］。

　　2　临床应用研究

　　2.1　淋巴结微转移的检测

　　淋巴结转移与否是大肠癌病人重要预后因素之一。常规组织学检测淋巴结微小转移常有遗漏，直接影响着临床分期的准确性、预后预测以及辅助治疗的选择。Mori等^［6］曾对65例行根治术的消化道肿瘤(大肠癌20例)及乳腺癌病人的406枚淋巴结分别进行组织学和CEA mRNA RT－PCR检测，并随访(24±12)个月，结果163枚组织学检测阴性而RT－PCR检测阳性，微转移检出率为40.1%，82枚二者检测均阳性，其余161枚以及25枚对照组淋巴结二者检测均阴性。有淋巴结转移的15例病人6例复发，29例只有微转移的病人4例复发，21例无转移者无复发，证实了CEA mRNA RT－PCR诊断肿瘤淋巴结微转移的敏感性及特异性。Wong等^［7］还连续对14例行根治术的大肠癌病人的区域淋巴结进行CD44v mRNA RT－PCR检测，结果9例阳性，其中1例常规组织学检测阴性。Gunn等^［8］也曾对15例大肠癌病人的109枚淋巴结同时进行CK19和CK20 mRNA RT－PCR检测，结果84枚CK19阳性，26枚CK20阳性。对照组的40枚淋巴结中，34枚CK19阳性，无一CK20阳性。作者认为，作为大肠癌淋巴结微转移的标志CK19 mRNA缺乏特异性，相反，CK20 mRNA具有较高特异性，应当作进一步的研究。骆成玉等^［5］就以CK20 mRNA为模板对17例大肠癌的150枚淋巴结行RT－PCR检测，结果17例大肠癌经常规组织学和CK20 RT－PCR检出淋巴结转移分别为6例和9例；150枚淋巴结用常规组织学和CK20 RT－PCR检出癌转移分别为19枚和45枚(P＜0.01)。常规组织学检查阴性的131枚淋巴结，经CK20 RT－PCR检出微转移26枚(19.8%)。随访中发现，淋巴结微转移多者预后差。因此，CK20 RT－PCR法较常规组织学检查具有更高的敏感性，提高了淋巴结微转移的检出率和临床分期的准确性。以上结果均提示RT－PCR对检测大肠癌淋巴结微转移有较大实用价值，使部分组织学检查无淋巴结转移病人中具有高危复发和转移倾向者得益于辅助治疗。

　　2.2　外周静脉血微转移的检测

　　血行转移是大肠癌另一种主要转移途径。检测大肠癌外周血微转移，对判断病人预后、指导术后辅助治疗同样具有重要意义。常规组织学检查难以实现外周血微转移的诊断，而RT－PCR技术由于其高度敏感性和特异性，使外周血中癌细胞的检测成为现实。Mori等^［9］采用RT－PCR法检测55例消化道肿瘤(大肠癌20例)及乳腺癌病人外周血的CEA mRNA，结果对照组阴性，41例行根治术病人中11例(27%)CEA mRNA阳性，认为不仅乳腺癌而且消化道肿瘤是全身性疾病。已发现转移的14例病人9例阳性，作者认为可能因为癌细胞间断性地进入血循环，多次采血可提高阳性率。Wong等^［7］分别对24例大肠癌及3例对照病人的外周血进行CD44v mRNA RT－PCR检测，结果24例大肠癌血标本中4例(16.7%)阳性，而3例对照病人血标本均阴性。Funaki等^［2］则采用CK20 mRNA RT－PCR法检测外周血中的大肠癌细胞，结果显示该法具有高度敏感性，1mL健康志愿者血中混合1个肿瘤细胞即能检出。8例大肠癌病人中，6例外周血中CK20 mRNA阳性，其中4例术前已有远处转移，2例术前未见转移，但1例术后11个月出现腹腔复发。CK20 mRNA阴性的2例病人，术后随访16个月仍未见复发。因此作者建议，应将具高度敏感性和特异性的CK20 mRNA RT－PCR法用于筛选大肠癌外周血微转移。骆成玉等^［10］还应用CK20 mRNA RT－　PCR法，通过检测72例大肠癌术前和术中不同时期外周血中微转移情况，从临床化疗疗效和分子水平分析术后化疗后微转移的消退的相关因素。结果，术前外周血中查出CK20阳性表达42例(58.3%)，术后3天外周血CK20阳性检出较术前多5例，术后经早期化疗后22例转阴。作者因此认为术后早期短程化疗对控制大肠癌微转移有一定作用。该研究有助于指导辅助治疗药物的选择和治疗方案的确定，可作为临床个体化治疗的重要参考。

　　2.3　骨髓微转移的检测

　　血流丰富的骨髓易发生癌细胞转移。早期大肠癌就有通过血路播散的可能，因此了解大肠癌病人骨髓微转移的状况，有助于血行转移的早期诊断，并对判断肿瘤恶性程度和病人预后及指导术后辅助治疗方案的选择都有重要意义。Gerhard等^［11］曾采用CEA mRNA巢式RT－PCR法检测15例腹部恶性肿瘤(大肠癌10例)骨髓微转移，并与免疫组化技术作对照，结果显示CEA mRNA巢式RT－PCR较免疫组化法更敏感。Gunn等^［8］除对15例大肠癌区域淋巴结作了CK19和CK20 mRNA RT－PCR检测外，还对该15例骨髓标本进行检测，结果CK19阳性6例，但无一例CK20阳性。而对照组12个骨髓标本中的5个CK19阳性，但无一对照标本CK20阳性。作者因此对CK19 mRNA RT－PCR的特异性产生怀疑。相反，倾向于以CK20 mRNA作为大肠癌骨髓微转移的标志。临床上可根据大肠癌病人骨髓中癌细胞的检出结果进行针对性的辅助化疗。特别是对于Dukes A、B期的病人，化疗的针对性尤为重要。因为骨髓中检出癌细胞，表明病人已存在血液的微转移，不能再作为早期病人对待，应及时合理地辅助治疗，以降低病人术后癌肿的转移和复发率，改善预后，提高5年生存率。大肠癌病人根治手术后，原发灶被切除，不再有癌细胞释放入血，再通过术后的辅助化疗有效地消灭骨髓内微转移的癌细胞，必然大大降低病人转移灶的形成及病情的复发率。手术及术后辅助化疗后骨髓微转移持续存在的病人，其复发或发生远处转移的可能性较大。对这类病人的严密随访检查就显得至关重要，以便早期发现复发或转移，从而早期治疗。因此动态观察大肠癌病人骨髓微转移为判断治疗效果和实施个体化治疗方案提供了一个较为客观的参考指标，并可作为检测病人术后早期复发或转移的一项重要参数。

　　2.4　腹腔微转移的检测

　　大肠癌侵及浆膜预后差，5年生存率低。癌细胞脱落到腹腔是腹膜种植转移的主要原因，腹腔冲洗细胞学检查可预测预后，但缺乏敏感性，阴性结果者仍有腹膜转移。Nakanishi等^［12］报告了以CEA mRNA RT－PCR法检测消化道肿瘤腹腔内脱落癌细胞，结果对照组均阴性，阳性率为31%(15/48)，敏感性显著高于细胞学检查，而且阳性率与肿瘤浸润深度相关，阴性病人(33例)随访659天，无腹膜复发。因此，通过CEA mRNA的检测可以准确判断腹腔转移。

参考文献

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(2000-06-16收稿，2000-07-10修回)