人肺癌细胞NHE-1基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

　　第三军医大学学报2000年第22卷第6期

黄桂君　吴国明　张青　钱桂生

　　摘　要： 目的　构建人肺癌细胞Na⁺/H⁺交换泵-1(Na⁺/H⁺ exchanger-1,NHE-1)基因的反义表达载体，为将来能在体内应用抑制NHE-1基因表达的肿瘤治疗奠定基础。方法　采用PCR技术从人肺癌A549细胞基因组中克隆出长为454 bp的NHE-1基因外显子部分序列，在上、下游引物的5'-端带上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。然后将该片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点。最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。结果　经琼脂糖凝胶电泳鉴定，所克隆的目的片段大约为467 bp，并成功地连接到pLXSN载体上，而DNA测序证实克隆并插入到载体中的片段为目的片段。结论　本实验已成功地克隆了NHE-1的目的片段，并将其反向插入到pLXSN中，构建了NHE-1反义表达载体pNHE-1。

　　关键词：NHE-1基因；肺肿瘤；反义技术；重组载

　　Na⁺/H⁺交换泵(Na⁺/H⁺ exchanger, NHE)基因家族有5个亚型，分别命名为NHE-1，2，3，4及β-NHE。其中NHE-1是一种管家基因，能通过Na⁺/H⁺交换将胞内H⁺排出，从而维持细胞内pH(pHi)的稳定。肿瘤细胞由于其糖酵解的反巴士德效应，导致酸性产物异常增加，但肿瘤细胞可依靠其表达增强的NHE-1膜蛋白，将细胞内H⁺泵出细胞外，阻止癌细胞酸化^［1,2］。而目前已经证实细胞内的H⁺蓄积和pHi降低将会诱发细胞凋亡^［3］。我们的前期工作亦已证明人肺癌组织NHE-1基因的表达比正常肺组织高12倍左右^［5］。因此，抑制人肺癌细胞NHE-1基因上调表达将可能诱发细胞酸化和凋亡，达到肿瘤治疗的目的。本研究试图从人肺癌细胞株A549细胞中克隆NHE-1基因的部分序列，并构建其反义表达重组载体。为将来能在体内应用NHE-1基因抑制的肿瘤治疗研究奠定基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　A549细胞NHE-1基因片段的克隆

　　1.1.1A549细胞的培养采用RPMI1640培养基按常规方法培养肿瘤细胞。

　　1.1.2　基因组DNA的提取　　按常规方法提取A549细胞基因组DNA。

　　1.1.3　PCR引物的设计与合成　　根据Sardet等^［4］克隆的人NHE-1基因序列，设计以下一对引物（由上海生工生物工程公司合成）：

　　P1(正义引物)：5'-tcg gat cca gtc act ttc ctc agc-3'

　　BamHⅠ

　　P2(反义引物)：5'-cga att caa cca cca cga gta agg-3'

　　EcoRⅠ

　　该对引物可扩增NHE-1基因第1外显子序列，相当于其cDNA的-384 bp至+70 bp处的序列，长为454 bp。引物5'端带上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点便于反向连接于病毒载体的5'-LTR启动子下游(含酶切位点PCR产物长为467 bp)。

　　1.1.4　PCR条件　　95℃预变性5 min后加入Taq酶（sangon产品），然后94℃变性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸45 s。作35个循环，末次循环72℃延伸5 min。

　　1.1.5　PCR产物纯化及酶切　　取PCR产物走1%琼脂糖电泳，待引物二聚体与扩增片段分离后，切下扩增片段，再用“V”型DNA电泳洗脱回收槽回收该凝胶中的目的片段，用酚/氯仿抽提、纯化；纯化片段用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，反应完毕后加等体积酚/氯仿抽提1次，无水乙醇沉淀、离心，用20μl去离子水溶解后，置-20℃保存备用。

　　1.2　NHE-1基因反义表达载体的构建

　　1.2.1构建策略，见图1

图1　构建策略图

　　fig 1　Construction strategy

　　1.2.2　pLXSN质粒(5 843 bp, Dr. miller惠赠)　　用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，等体积酚/氯仿抽提1次，离心沉淀，用去离子水溶解，并置-20℃保存备用。

　　1.2.3　DNA重组连接　　连接反应体系由10×Buffer 10 μl，酶切后的PCR扩增片段3μl(3.9 μg)，上述酶切后的pLXSN载体1.3 μl(1.3 μg)，T4连接酶8 μl，水77.7μl组成，合计100 μl；在16℃条件下连接16 h。

　　1.2.4　重组载体(pNHE-1)的细菌转导　　采用电穿孔法。取45 μl xL1-Blue感受态细菌，加入2 μl重组载体（连接反应液），混匀后加入电穿孔杯中，采用电穿孔仪(美国Bio-Rad产品)在电压为1.25 kV，电容25 μF，电阻200Ω的条件下电击细菌4～5 ms。立即用1 ml sOC轻轻冲洗细菌并转移至培养管中，于37℃，225 r/min振摇1 h。取100μl转化细菌涂布于半固体培养基(含100 μg/ml Amp)筛选平板上，37℃孵育箱中过夜。

　　1.3　pNHE-1的鉴定

　　1.3.1酶切鉴定　　从筛选平板上挑取菌落，接种于3ml LB培养基中(含100μg/ml Amp)，37℃振摇过夜。收集细菌采用碱裂解法小量提取质粒。采用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切提取的质粒DNA，进行电泳鉴定。

　　1.3.2　测序鉴定　　经初步鉴定pNHE-1为设计的反义重组子后，对重组质粒DNA进行序列测定。测序引物为我们设计的上游引物，采用 aBI377全自动DNA测序仪（基康公司），应用四色荧光、双脱氧终止法进行测序。

　　2　结果

　　2.1　目的片段的克隆，见图2

　　结果显示PCR产物与预期的长度相吻合，提示扩增的DNA片段为目的片段。

图2　目的片段及pNHE-1的酶切电泳鉴定结果泳道1：小分子量marker；泳道2：PCR产物；泳道3：pNHE-1双酶切后释放的目的片段；泳道4：双酶切的 pLXSN ；泳道5：Marker（λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ）

　　fig 2　Electrophoresis of objective DNA fragment

　　and enzyme cleaving pNHE-1

　　lane 1:low molecular marker; Lane 2:PCR product; Lane 3:pNHE-1 double enzyme cleaving; Lane 4:pLXSN double enzyme cleaving; Lane 5:DNA marker （λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ）

　　2.2　pNHE-1的酶切鉴定，见图2

　　重组载体在双酶切后释放出一约462 bp的短片段，提示扩增的片段已成功地插入载体DNA中。

　　2.3　pNHE-1中目的片段的测序结果

　　测序结果表明我们所克隆的目的片段与Sardet等人于1989年报道的几乎完全一致，只是在-360和-364分别有C和G插入。

　　3　讨论

　　实验结果表明，我们已经成功地克隆了目的片段，并将该片段反向插入到逆转录病毒载体pLXSN上，成功构建了NHE-1的反义表达载体pNHE-1。测序结果显示所克隆的目的片段与他人报道的NHE-1相应序列有细微差异，这种差异可能与肿瘤组织细胞NHE-1基因突变有关；亦不排除为PCR扩增时所产生的错配所致，但我们扩增的序列不足500 bp，2个碱基的差异以前者的可能性更大。因此直接从肿瘤细胞克隆NHE-1基因片段并构建其反义表达载体，对肿瘤细胞基因表达的抑制可能具有一定的选择性。

　　以往采用PCR克隆基因及构建其反义表达载体均从mRNA入手，而RNA提取条件严格，还需逆转录步骤，耗时耗力。由于在反义技术中，一般针对基因cDNA的任何序列均可产生抑制效应，因此，在本实验中我们设计引物直接从基因组DNA扩增对应于NHE-1 cDNA的序列，而该序列含5'端非翻译区和翻译起始密码子，并从基因组直接转录而来，不经剪接加工。这样既可获得反义抑制的最有效靶序列，又省时省力。我们在引物设计时还加入了酶切位点，使NHE-1基因片段按反向插入要求连接到pLXSN上，从而也使重组载体构建工作高效简便。目前，以缺陷病毒为载体在有机整体中表达外源基因，仍然是肿瘤基因治疗的活跃领域。近年我们的研究发现，人肺癌组织细胞的NHE-1基因mRNA表达较正常肺组织增高约12倍^［5］；在细胞培养的实验中亦证明，针对NHE-1的反义寡聚脱氧核苷酸对人肺癌细胞具有抑制NHE-1活性，酸化肿瘤细胞的作用，并能诱导肺癌细胞的凋亡^［6］。因此，NHE-1基因反义表达载体的构建，为将来实施NHE-1基因抑制的肿瘤治疗研究奠定了基础。我们相信这一工作将具有重要价值

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（39900067)

　　作者简介：黄桂君(1964-)，男，广西省南宁市人，博士，主治医师，讲师，主要从事肺癌、疾病基因组方面的研究，发表论文12篇。电话：(023)68755644黄桂君（第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆400037)

　　吴国明（第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆400037)

　　张青（第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆400037)

　　钱桂生（第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆400037）

　　参考文献：

　　［1］　Garcia-Canero r, Trilla C, Perez de Diego J, et al. Na⁺/H⁺ exchange inhibition induces intracellular acidosis and differentially impairs cell growth and viability of human and rat hepatocarcinoma cells［J］. Toxicol Lett,1999,106(2-3):215-228.

　　［2］　Strazzabosw M, Poci C, Zsembery A, et al. Intracellular pH re-gulation in Hep G2 cells: effects of epidermal growth factor, transforming growth factor-α and insulinlike growth factor-Ⅱ in Na⁺/H⁺ exchange activity［J］. Hepatology,1995,22(2):588-597.

　　［3］　黄桂君，钱桂生．pH对细胞凋亡的调控及pH调节的肿瘤治疗研究［J］．科学，1997,228(8):51-52.

　　［4］　Sardet C, Franchi A, Pouyssegur J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na⁺/H⁺ antiport［J］. Cell,1989,56:271-280.

　　［5］　黄桂君，厉为良，钱桂生，等.人肺癌组织细胞NHE-1mRNA表达及其意义的研究［J］.中华结核和呼吸杂志,1998,21(10):636.

　　［6］　Wu Guoming, Huang Guijun, Qian Guisheng, et al. Acidification and apoptosis of human lung cancer cells induced with antisense nucleotides against nHE-1［J］. J Med Coll PLA, 1998,13(4):291-293.