耐多药相关蛋白在人非小细胞肺癌组织中的表达

中华结核和呼吸感染 1999年第11期第22卷 论著

作者：彭向红　冯奉仪　张伟　吴炳富　常绍静　金顺钱

单位：彭向红、冯奉仪　100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤内科 张伟、吴炳富、常绍静、金顺钱　肿瘤生物学检测中心

　　关键词： 肺肿瘤；耐多药相关蛋白；聚合酶链反应；免疫组织化学；预后

　　【摘要】　目的　检测人非小细胞肺癌组织中耐多药相关蛋白(MRP)的表达，探讨其与瘤组织学类型、分化程度、临床分期及预后的关系。方法　采用免疫组化方法及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，分别检测了92份人非小细胞肺癌石蜡组织中MRP的表达及16份人非小细胞肺癌新鲜组织中MRP基因的表达。结果　92份人非小细胞肺癌组织中(鳞癌43例，腺癌49例)MRP表达阳性检出率为54%(50/92)，16份人非小细胞肺癌组织中MRP基因表达阳性检出率为31%(5/16)。MRP在腺癌中的表达阳性率明显高于鳞癌(P＜0.05)，MRP表达与瘤分化程度、肿瘤大小及淋巴结转移无显著相关。MRP阳性患者术后5年生存率为16%(8/50)，MRP阴性患者术后5年生存率为52%(22/42)，二者经统计学处理，差异有显著性(P＜0.05)。MRP阳性患者术后5年生存率有随其瘤组织中该蛋白表达阳性程度的增加而降低之趋势。结论　非小细胞肺癌患者瘤组织中MRP的表达与瘤组织学类型及预后明显相关。

Expression of multidrug resistance-associated protein in human non-small cell lung cancer

PENG Xianghong, FENG Fengyi,ZHANG Wei,et al.

　　Dept. of Medical Oncology, Cancer Hospital, CAMS and PUMC, Beijing 100021

　　【Abstract】　Objective　To investigate the expression of the multidrug resistance-associated protein(MRP) gene and MRP in human non-small-cell lung cancer tissues and to determine whether such expression was related to cell type, differentiation, tumour size,lymph node metastasis and prognosis.Methods　92 paraffin-embeded lung tumor samples (43 squamous cell carcinoma, 49 adenocarcinoma) and 16 fresh non-small-cell lung cancer samples were examined by using immunohistochemistry method and the reverse transcription-polymerase chain reaciton (RT-PCR) technology respectively.Results　The expression of MRP mRNA and MRP were detectable in 31% (5/16) and 54% (50/92) of non-small-cell lung cancer specimens respectively. Eighteen(42%) squamous cell carcinoma specimens and thirty-two(65%) adenocarcinoma specimens showed positive immunostaining for MRP(P＜0.05). The expression of MRP was not related to tumour size, lymph node metastasis and cell differentiation significantly(P＞0.05).The five -year survival rate after operation of patients with MRP-positive tumours and MRP-negative tumours were 16%(8/50),52%(22/42) respectively.Patients with MRP-positive tumours had shorter survival time than the MRP-negative patients significantly(P＜0.01).Conclusions　Adenocarcinoma had higher MRP expression than squamous carcinoma significantly,positive MRP immunostaining appears to be an independent indicator of poor prognosis in NSCLC.

　　【Key words】　Lung neoplasm　　Multidrug resistance-associated protein　　Polymerase chain reaction　　Immunohistochemistry　　Prognosis

　　肺癌已成为目前人类因癌症死亡的主要原因。据统计，肺癌患者总的治愈率约13%^［1］，化学治疗在肺癌的治疗中仍然发挥着重要的作用。但肿瘤对化疗药物的先天耐药及获得性耐药仍是目前导致化疗失败的主要原因。

　　诸多研究认为，目前公认的在肿瘤耐药中起重要作用的耐多药基因(MDRI)及其编码的P-gp在人肺癌组织中的表达较低，不能完全解释肺癌的耐药机制，推测尚有其它机制起作用^［2,3］。

　　耐多药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)基因是于1992年由Cole等^［4］从一株起源于人小细胞肺癌(SCLC)的耐阿霉素(ADM)的细胞株H69/AR中克隆出的耐药相关基因，编码一相对分子质量为190 000的蛋白，通过将药物排出胞外而导致耐药的发生。有文献报道，其可能与肺癌耐药及预后相关，但其表达与肺癌类型、分化程度、分期的关系尚无定论^［3,5］。我们采用免疫组化方法及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，分别检测了92份人非小细胞肺癌(NSCLC)石蜡组织中MRP的表达及16份人NSCLC新鲜组织中MRP基因的表达，现将结果报告如下。

　　材料与方法

　　一、标本来源

　　92份人NSCLC石蜡组织标本取自1989年3月～1992年3月本院外科手术切除的肺癌组织。患者随访资料完整，最长随诊至1997年10月。男62例，女30例，年龄40～65岁，中位年龄51.5岁。鳞癌43例，腺癌49例。NSCLC患者TNM分期：Ⅰ期41例，Ⅱ期34例，Ⅲ期17例。高分化12例，中分化52例，低分化28例。16份人肺癌新鲜组织标本取自1995年10月～1996年10月本院外科手术切除的肺癌组织(鳞癌及腺癌各8例)。所有病例均有明确的病理诊断且术前均未接受化、放疗。新鲜标本离体2小时内取材，取材后置于液氮中冰冻后放入-80℃冰箱保存。

　　二、细胞株及单抗

　　MRP阳性细胞株GLC4/ADM(耐ADM的SCLC细胞株)及单抗MRPr1(鼠源性)均由荷兰大学自由医学院病理科Scheper教授赠送。

　　三、RNA抽提

　　使用异硫氰酸胍一步抽提法提取瘤组织、耐药细胞总RNA^［6］，提取的RNA使用岛津紫外分光光度仪测波长260 nm下的吸光度［A，曾称光密度(OD)］值以确定其浓度。

　　四、RT-PCR

　　使用美国GIBCO BRL公司的M-MLV逆转录试剂盒，取3 μg总RNA按说明使用Oligo(dT)合成cDNA。PCR所用引物如下：β-肌动蛋白^［7］：5′-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3′，5′-TCATCACCATTGGCAATG-AG-3′，扩增片段156 bp；MRP^［8］：5′-GTCTTCAGGGATCATGCTCAC-3′, 5′-GCGCATTCCTTCTTCCAGTTC-3′，扩增片段399 bp。

　　以上引物均由美国Cybersyn公司合成，β-肌动蛋白作为内对照，GLC4/ADM细胞株作为MRP阳性对照。

　　取100 ng的cDNA作PCR，50 μl反应体系中加入10×PCR缓冲液5 μl(内含15 nmol/L MgCl₂)，10 mmol/L dNTP混合物1 μl，β-肌动蛋白与MRP引物各40 pmol，加入Taq酶2.5 U。反应体系置于PCR自动扩增仪(Perkin-Elmer产品)扩增30个循环。反应条件如下：94℃变性1分钟，65℃退火5分钟，72℃延伸5分钟^［7］。扩增完毕后取10 μl PCR产物在含溴化乙啶的2%的琼脂糖凝胶上电泳并照相。紫外灯下观察，如399 bp处有带者为MRP基因阳性。

　　五、石蜡切片制备

　　92份人肺癌组织石蜡块，连续切片(厚5 μm)，将切片贴附于经多聚赖氨酸处理的玻片上，69℃烘片2小时备用。

　　六、免疫组织化学分析

　　按说明书用北京中山公司生产的SP试剂盒进行检测，MRP单抗(MRPr1)浓度10 μg/ml，工作浓度1∶50。以PBS代替MRPr1单抗作空白对照，以GLC4/ADM作为阳性对照。DAB染色，苏木素复染，以胞浆或膜呈黄色作为MRP阳性，切片中有5%～25%细胞染为黄色者判定为弱阳性(+)，26%～50%细胞染为黄色者定为中度阳性(++)，大于50%细胞染为黄色者定为强阳性(+++)^［5］。

　　七、统计学处理

　　结果采用χ²检验，用医学统计软件SPSS处理。用Kaplan-Meier法比较生存曲线。

　　结果

　　16份人肺癌新鲜组织中可检测到MRP基因表达者共5例(5/16)，其中鳞癌3例(3/8)，腺癌2例(2/8)。MRP基因表达的PCR结果见图1。

1～4为阳性标本　5、6分别为阳性、阴性对照　M为标志物，自下而上分别为121 bp、383 bp、916 bp

　　图1　RT-PCR检测MRP基因表达结果

　　92份肺癌石蜡组织中有50份可检测到MRP的表达，总表达率为54%。其中，43例鳞癌组织中有18例表达，阳性表达检出率42%(18/ 43)，弱阳性者3例，中度阳性7例，强阳性8例。49例腺癌组织中有32例可检测到MRP的表达，阳性表达检出率65%(32/49)。其中6例弱阳性，8例中度阳性，18例强阳性。MRP在腺癌组织中的表达阳性检出率明显高于鳞癌(P＜0.05)。MRP表达强弱与瘤类型无显著相关(见表1，图2，3)。

表1　MRP表达与NSCLC瘤组织学类型的关系

图2　肺腺癌MRP阳性，可见细胞浆，细胞膜染为黄色　DAB染色，苏木素复染　×200

图3　肺鳞癌MRP阳性，可见细胞浆，细胞膜染为黄色　DAB染色，苏木素复染　×200

　　本实验组NSCLC瘤组织中，高、中、低分化者MRP表达阳性率分别为50%(6/12)、50%(26/52)、64%(18/28)。T₁、T₂、T₃患者MRP阳性率分别为47%(8/17)、58% (41/71)、25%(1/4)，统计学处理无显著性差异。N₀、N₁、N₂患者MRP阳性率分别为44%(17/39)、59%(23/37)、71%(10/14)，统计学处理MRP表达与淋巴结转移无明显相关,但提示随着肿瘤浸润范围的加大，MRP阳性率有逐渐增加之趋势。

　　92例NSCLC患者总的术后5年生存率为33%(30/92)，其中MRP阳性者5年生存率为16%(8/50)，而MRP阴性者5年生存率为52%(22/42)，统计学处理有显著性差异(P＜0.05)。26例MRP强阳性者，5年生存率为8%(2/26)，15例中度阳性者5年生存率为20%(3/15)，9例MRP弱阳性者5年生存率为33%(3/9)，尽管统计学处理无显著性差异，但结果仍提示，NSCLC患者MRP阳性患者5年生存率有随其阳性程度的增强而降低之趋势。

　　讨论

　　据报道，NSCLC的联合化疗有效率约14%～40%，其对化疗药物的先天耐药及获得性耐药仍是导致化疗失败的重要原因^［2］。

　　MRP基因定位于染色体16P13.1，长约7.8～8.2 kb,编码一1 531个氨基酸、相对分子质量为约190 000的蛋白(MRP)。MRP属ATP结合的盒式超家族转运系统(ABC蛋白)的成分，在原核、真核生物中一系列的分子跨膜转运中起重要作用，由疏水的跨膜部分及与核苷酸连接的区域组成。P-gp亦属于此系统的组成成分。MRP与P-gp的NH₂-及COOH-末端极少相同，其氨基酸的同源性＜15%,MRP可通过改变胞浆及细胞器的pH值，使药物到达其作用的部位浓度减少，并逆浓度梯度减少胞内药物浓度而导致耐药的发生,目前认为其介导阿霉素(ADM)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、长春花碱酰胺(VDS)、长春新碱(VCR)等的耐药^［9］。

　　我们检测了MRP基因及MRP在人NSCLC组织中的表达。RT-PCR法检测结果示16例肺癌组织中MRP基因表达阳性者5例(5/16)，免疫组化结果表明，NSCLC患者MRP阳性率54%(50/92)，其中鳞癌阳性率为42%(18/43)，腺癌为65%(32/49)，统计学处理腺癌中该蛋白表达的阳性率明显高于鳞癌。MRP基因及MRP表达与NSCLC瘤分化程度、肿瘤大小无显著相关。尽管MRP表达与淋巴结转移无显著相关，但随着淋巴结转移范围的加大，MRP阳性率有逐渐升高之趋势。NSCLC患者中MRP表达阳性者预后较阴性者差。MRP阳性表达者5年生存率随其表达程度的增高而逐渐降低，推测MRP表达可能与肿瘤浸润相关而影响预后，统计学处理无显著性差异，可能与本组标本例数少有关。

　　Sugawara等^［8］用免疫组化法检测了81例人肺癌组织中(59例腺癌，10例鳞癌，5例大细胞肺癌，5例SCLC，2例类癌)MRP的表达,发现47%(28/59)腺癌、20%(2/10)鳞癌中有MRP表达，而5例SCLC中未见该蛋白的表达，提示腺癌中MRP表达的阳性率明显高于鳞癌。腺癌组织中高分化者MRP表达阳性率(56%)，显著高于低分化者(22%)。Ota等^［3］用Northern法检测了104例NSCLC瘤组织中(59例腺癌，40例鳞癌，4例大细胞癌，1例腺鳞癌)MRP基因的表达，发现31.7%(33/104)瘤组织中有不同水平的表达，40%(15/40)鳞癌、25.4%(15/59)腺癌、50%(2/4)大细胞癌为阳性，19例高表达者中，鳞癌13例(68.4%)、腺癌5例(26.3%)，表明鳞癌组织中MRP基因表达水平显著高于腺癌(P＜0.05)。61例患者术后接受MRP相关药物化疗(VDS+VP-16)，23例(37.7%)MRP基因中、高度表达者术后生存期显著较低表达或阴性表达者短。进一步分析表明，20例鳞癌患者术后接受化疗，9例MRP基因中-高度表达者生存期显著低于11例无或弱表达者，而腺癌患者差异不明显。由于所用单抗及检测方法不一，本研究结果与Sugawara等的并不完全一致，Ota等与我们从不同水平检测了MRP的表达，由于MRP表达涉及到翻译后水平的调节，故难以进行比较。

　　本研究表明MRP基因及MRP在人NSCLC瘤组织中有一定比例的表达，与NSCLC的预后相关，这一研究结果为今后进一步开展临床应用研究、阐明肺癌耐药机制奠定了良好的基础。

　　日后尚需多中心的广泛合作，进一步明确MRP在人肺癌组织中的表达及与耐药、预后的关系

　　参考文献

　　1　Bunn PA. Future directions in clinical research for lung cancer.Chest,1994, 106:399-406.

　　2　Sugawara I,Kataoka I,Morishita S,et al. Tissue distribution of P- glycoprotein encoded by a multidrug resistant gene as revealed by a monoclonal antibody,MRK-16.Cancer Res,1988,48:1926-1929.

　　3　Ota E,Abe Y,Oshika Y,et al. Expression of the multidrug resistance-associated protein(MRP)gene in non-small-cell lung cancer.Br J Cancer,1995,72:550-554.

　　4　Cole SPC,Geriach BJH,Mackie JE,et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.Science,1992,258:1650-1653.

　　5　Izquierdo MA,Shoemaker RH,Flens MJ,et al.Overlapping phenotypes of multidrug resistance among panels of human cancer cell lines.Int J Cancer，1996,65:230-270.

　　6　Chomczynski P,Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987, 162：156-169.

　　7　Scheffer GL,Wijing PLJ,Flens MJ,et al.The drug resistance related protein LRP is a major vault protein.Nat Med,1995,1:578-582.

　　8　Sugawara I,Yamada H,Nakamura H,et al.Preferential expression of the multidrug-resistance-associated protein in adenocarcinoma of the lung .Int J Cancer, 1995,64:322-325.

　　9　Zaman GJR, Lankelma JL,Tellingen OV,et al.Role of glutathione in the export of compounds from cells by the multidrug-resistance-associated protein.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:7690-7694.

(收稿：1999-01-25　　修回：1999-04-15)