胰腺癌抗原SC6的分离及其特性分析

世界华人消化杂志 1999年第7期第7卷 研究原著

作者：刘民培　周景春　郭晓钟　陈　伟　戴　兵　安天义　马世英

单位：沈阳军区总医院医学实验科　辽宁省沈阳市　110015

关键词：胰腺肿瘤；重组噬菌体抗体；SC6抗原

　　摘　要

　　目的　获得胰腺癌重组噬菌体抗体筛检及鉴定的靶抗原.

　　方法　用protein A-sepharose 4B柱纯化的单抗SC6吸附到CNBr-sepharose 4B特异亲合层析柱上，分离出SC6抗原，再用SDS-PAGE，Western blotting、免疫化学和氨基酸自动分析仪等检测其有关的特性.

　　结果　此抗原在SDS-PAGE, Western blotting上显示一条带，M_r 670000，性质属糖蛋白，其中含17种氨基酸，与CA19-9等多种抗原不同，在胰腺癌组织中的阳性表达率为91.2%.

　　结论　该抗原是一种与胰腺癌相关的新肿瘤标志物，这为其分子克隆等研究提供了新的抗原蛋白.

　　中国图书馆分类号　R735.9

Purification and characterization of antigen SC6 for pancreatic cancer

LIU Min-Pei, ZHOU Jing-Chun, GUO Xiao-Zhong, CHEN Wei, DAI Bing, AN Tian-Yi and MA Shi-Ying

　　Department of Experimental Medicine, Beifang Hospital, Shenyang 110015, Liaoning Province, China

　　Subject headings　pancreatic neoplasms; recombinant phage antibody; SC6 antigens

　　Abstract

　　AIM　To obtain a target antigen for planning recombinant phage antibody (RPA) of pancreatic cancer.

　　METHODS　Purification of the antigen was performed by affinity chromatography on CNBr-sepharose 4B columns binding monoclonal antibody SC6 purified by protein A-sepharose 4B columns. Nature of the purified antigen was examined by SDS-PAGE, Western blotting, immunochemistry, automatic analyzer of amino-acid, etc.

　　RESULTS　Detected by SDS-PAGE and Western blot,ting, the separated antigen was a single band. And this antigen was characterized as glycoprotein with a relative molecular weight of around 670000 and with 17 amino-acids. The antigenic determinant is different from those of CA19-9, Span-1, TAG-72 and several other cancer directed antibodies. 91.2%of pancreatic cancer specimens had SC6 reactivity.

　　CONCLUSION　The malignancy-associated structures identified by SC6 may provide new information on the carbohydrate and peptide structure of pancreatic cancer. And a new target antigen of screen and detection used in its RPA is provided by the antigen SC6.

　　0　引言

　　在重组噬菌体抗体(RPA)的制备中，欲获得特异性抗体的关键环节是通过固相化抗原对RPA的淘筛(panning). 其中只有性质较为明确的抗原，才能筛检到其反应性更为理想的抗体. SC6抗原(SC6Ag)是单抗SC6^［1］所识别的一种对胰腺癌的检测有较高应用价值的肿瘤相关抗原^［2，3］. 我们对此抗原的纯化及有关特性的分析，旨在为其基因工程抗体的免疫筛检提供吸附等用的抗原纯品.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　①单抗SC6由本院研制^［4］，其Ig亚类为IgG1^［5］. 免疫组化染色用其杂交瘤细胞培养的上清液，其他试验均为用其腹水的纯化品. ②蛋白A-sepharose 4B亲合层析柱和溴化氰活化琼脂糖凝胶珠(CNBr-sepharose)特异亲合层析柱均为Sigma产品. ③所用的恶性肿瘤、成人正常组织和胎儿组织均由我院有关科室提供. ④ABC试剂盒为美国Vector产品. ⑤采用的已知抗原有CA19-9和TAG-72为美国Abboott产品，Span-1为日本产品，CEA，AFP，β₂微球蛋白和铁蛋白放免试剂盒中的标准抗原均为北京中国原子能研究院产品.

　　1.2　方法　①单抗的纯化用腹水按文献［6］进行. ②SC6Ag的纯化用与单抗SC6反应阳性的胰腺癌组织制成匀浆，1.5g 4℃离心30min，取上清透析后为初提抗原. 用此抗原加入预吸附有纯化单抗SC6的CNBr-sepharose 4B柱中，0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱杂蛋白至吸光度A280值≤0.05，再用0.1mol/L pH6.0的柠檬酸纳缓冲液洗脱SC6Ag，收集洗脱液4℃透析，浓缩后测其活性和蛋白含量. ③ABC染色法见文献［7］. ④单抗SC6与其他抗原反应的测定用SC6Ag为阳性对照，以免疫双扩散法和按产品说明书进行. ⑤Western blotting技术见文献［1］. ⑥SC6Ag理化性质的测定见文献［8］. ⑦相对亲合常数的测定用包被液稀释纯化的SC6Ag为20mg/L，100μL/孔加入聚苯乙烯扳，37℃ 2h后4℃过夜；50mL/L马血清封闭后，加3mg/L按1∶2～128倍比稀释的单抗SC6，100μL/孔，4℃过夜，依次加入1∶600稀释的生物素化马抗鼠IgG和ABC复合物，各100μL/孔，各置37℃ 2h. 上述各步中用5mL/L Tween 20 PBS洗3次. 二氨基联苯胺(DAB)显色及终止反应后测吸光度A492值，并以SP2/0细胞培养上清作阴性对照，A值高于对照值的最大稀释度为终点浓度值. 然后依此值和IgG的M_r计算其相对的亲合常数. ⑧SC6Ag的氨基酸测定：纯化的SC6Ag用盐酸在105℃水解24h后，加入日本产的日立牌835-50型氨基酸自动分析仪柱中，按蛋白水解法测试. 整个分析操作由中国科学院沈阳分院理化测试中心生态环境测试部完成.

　　2　结果

　　纯化后的单抗SC6稀释至0.3mg/L时，免疫组化染色仍阳性，PBS对照为阴性；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示一条带，与CNBr-sepharose 4B的吸附率为93.4%. 纯化SC6Ag与纯化单抗SC6的免疫双扩呈一条沉淀线，纯化单抗与AFP，CEA，β₂微球蛋白及铁蛋白抗原无沉淀线；SC6Ag的SDS-PAGE显一条带，与单抗SC6的反应呈阳性.

　　2.1　SC6Ag在组织中的表达　单抗SC6识别的SC6Ag在48种409例组织中主要表达在胰腺、结肠、胃、肺等癌中，对应的正常成人及胎儿组织除极个别组织有轻度表达外其他组织均阴性(表1). 阴性反应的其他恶性肿瘤有：肝癌22例，脑肿瘤24例，肾、睾丸、皮肤和甲状腺癌各5例，卵巢癌4例，膀胱癌3例；正常成人的组织有：小肠16例，肝9例，子宫6例，睾丸4例，;卵巢3例，脑、心、肾、膀胱、胆囊、 甲状腺、肌肉和皮肤各5例；胎儿组织有：小肠20例，脑、心、肝、脾、肾、膀胱和皮肤各6例，胆囊、睾丸和卵巢各5例. 用纯化单抗SC6分别与SC6Ag，CA19-9，TAG-72，Span-1，CEA，AFP，β₂微球蛋白和铁蛋白8种抗原反应，其中除SC6Ag为阳性外，其余均为阴性.

表1　SC6Ag在不同组织中的表达

　　2.2　SC6Ag及mAb的理化性质　用高碘酸处理的SC6Ag与单抗SC6的反应阴性，经胰蛋白酶、神经氨酸苷酶、100℃加热及氯仿、甲醇和冰醋酸处理及对照的结果均阳性. SC6Ag经Western blotting显示一条带，M_r670000. 单抗SC6相对亲合力的测定结果：其相对亲合常数为1.46×10^-10. 纯化SC6Ag中经测定含有17种氨基酸，其中以赖氨酸的含量最高，天门冬氨酸次之，胱氨酸最低，而且不含粗蛋白(表2).

表2　SC6Ag蛋白中的氨基酸成分

　　3　讨论

　　在抗肿瘤基因工程抗体的筛检中，其靶抗原的获取至关重要，它即关系到重组抗体的质量，亦与其后的应用价值有关. 本研究的结果表明，SC6Ag在胰腺癌组织中的表达最高，且在43种不同组织中均无表达的一种与胰腺癌相关的肿瘤标志物. 而且此标志物与CA19-9，TAG-72和CEA等7种抗原不同，其M_r 670000等有关特性与文献［9，10］中报道的CA50等5种抗原比较亦不同. 此抗原为含17种氨基酸的糖蛋白，这对其氨基酸序列的推测，并从基因水平考虑其成分和作用均提供了有益的数据. 目前，已对翻译该抗原的mRNA进行其分子克隆. 该抗原经SDS-PAGE和Western blotting的测定均显示一条带，且在氨基酸的测定中未见粗蛋白，证明是一种高纯度的蛋白质. 这为此癌在基因工程抗体的筛检及测定等研究提供了新的靶抗原. 在本研究中，单抗SC6的相对亲合常数为1.46×10^-10. 这种较高的亲合力既有助于对应抗原的纯化，亦有助于其应用. 上述结果表明，SC6Ag是一种与已知胰腺癌相关抗原不同的新的肿瘤标志物，这对此癌的进一步探讨具有较高的理论及应用价值.作者简介：刘民培，男，1948-03-21生，四川省蓬溪县人，汉族. 1975年白求恩医科大学放射医学系毕业，1991～1993年北京军事医学科学院学习，主任医师，教授，主要从事肿瘤免疫学研究，发表论文80篇，获国家和省部级二等奖5项.

　　全军医药卫生科研基金课题，No.b96D002

　　通讯作者　刘民培，110015，辽宁省沈阳市沈河区文化路83号，沈阳军区总医院医学实验科.

　　Supported by Medical and Health Scientific Fund of the PLA, China, No.b96D002.

　　Correspondence to: Dr. LIU Min-Pei, Department of Experimental Medicine, Beifang Hospital, No.83 Wenhua Road, Shenhe District, Shenyang 110015, Liaoning Province, China

　　Tel. +86·24·23051421

　　4　参考文献

　　1　Liu MP, Ma SY, Zhou YL, Chen W, An TY, Chu JJ, Wang XL, Zhu SD, Wang JQ, Tang YH, Shi CY, Yang JR. Characteristics and reactivities of a panet of monoclonal antibodies recognizing human colon cancer associated antigens. Zhonghua Zhongliu Zazhi, 1992;14:91-93

　　2 Guo XZ, Liu MP, Li XX, An R, Ma SY, Liu ZF, Zhao XL, Li AP. Evaluation of serum SC6 antigen using immunoradiometric assay for diagnosis of pancreatic cancer. Zhonghua Neike Zazhi, 1992;31:84-86

　　3 Guo XZ, Liu ZF, An R, Zhao XL, Li FH, Wang KG. SC6 antigen for the diagnosis of pancreatic cancer before operation. Zhonghua Yixue Zazhi, 1993;73:26-28

　　4 Liu MP, Ma SY, Chen W, Dai B, Zhou YL, Wang XL, An TY, Song YG, Chu JJ. Studies on a series of SC monocional antibodies against colon cancer associated antigens. Zonghua Zhongliu, 1993;2:27

　　5 Ma SY, Liu MP, An TY, Chen W. Ig subclass of monoclonal antibodies detected by biantibodies sandwich-ELISA. Zhongguo Shiyan Linchuang Mianyixue Zazhi, 1991;3:15-16

　　6 Li CW, Modern immunochemistry technique. 1st ed. Shanghai: Shanghai Kexue Jishu Chubanshe, 1992:217-221

　　7 Liu MP, Zhou YL, Ma SY, An TY, Chu JJ. Comparative studies on ELISA and ABC immunohistochemical staining in screening of tumor McAbs. Mianyixue Zazhi, 1989;5:51-53

　　8 Liu MP, Ma SY, Li YX, An TY, Chen W, Wang XL, Zhou YL, Chu JJ. Immunohishtochemical analysis of physicchemical properties of target antigens with anti-tumor monclonal antibodies. Zhonghua Zhongliu Zazhi, 1992;14:6-9

　　9 Rthlin MA, Joller H, Largiadr F. CA242 is a new tumor marker for pancreatic cancer. Cancer, 1993;71:701-707

　　10 Ho JJL, Bi N, Yan PS, Yuan M, Norton KA, Kim YS. Characterization of new pancreatic cancer_reactive monoclonal antibodies directed against purified mucin. Cancer Res, 1991;51:372-380

收稿日期　1999-04-15