p53蛋白在鼻咽癌中的表达及其临床意义

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第11期

郑美莲　区宝祥　龙江斌　邓满泉　陈丽珍　梁启万　邝珠玑　李辉梅

　　摘　要目的：从基因水平探讨抑癌基因p53蛋白与鼻咽癌的关系。方法：本文采用Westernblot结合非放射性免疫沉淀技术，对鼻咽癌细胞株、鼻咽癌活检组织和鼻咽粘膜慢性炎症组织进行了p53蛋白表达的研究。结果：7株鼻咽癌细胞株均发现p53蛋白表达异常条带。104例鼻咽癌活检组织中有12例出现p53蛋白表达异常，检出率为11.54％。8例鼻咽慢性炎症活检组织中p53蛋白表达未见异常。12例p53蛋白表达异常的鼻咽癌患者有2例复发。结论：鼻咽癌组织中存在p53蛋白表达异常，鼻咽癌的发生、发展可能与抑癌基因p53蛋白的异常表达有关。

　　关键词：鼻咽肿瘤　p53蛋白　基因表达

　　p53基因结构改变及表达异常是人类肿瘤中常见的现象之一^[1]。p53基因除了能与其它多种基因协同作用控制细胞增殖、分化外，还参与细胞凋亡的调控。p53蛋白在鼻咽癌中表达的研究大多采用免疫组化的方法，本文采用Westernblot结合免疫沉淀分子生物学技术检测p53蛋白的表达与鼻咽癌的关系。旨在探讨p53蛋白表达与鼻咽癌发生、发展的关系及其临床意义。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源

　　1.1.1　鼻咽癌细胞株CNE₁（中国医科院病毒室及中山医科大学共同建立）、CNE₂－Z（湛江医学院）、HNE₁、HNE₂、HNE₃（湖南医科大学姚开泰教授赠送）、SUNE₁（本研究所病因室建立）和HK₁（香港中文大学Dr.DollyHuang赠送）。

　　1.1.2　鼻咽组织采自中山医科大学附属肿瘤医院鼻咽纤维镜检测标本。104例活检标本来自鼻咽癌初诊患者，全部标本均经临床和病理检查确诊为鼻咽癌。另取8例鼻咽粘膜慢性炎症标本作为对照。

　　1.2　方法

　　1.2.1　细胞裂解鼻咽癌细胞株用含10％小牛血清、RPMI－1640培养液培养于CO₂孵箱，恒温37℃，CO₂浓度5％。鼻咽癌细胞株传代后38～40小时，终止培养，加入细胞裂解液，刮下粘稠的裂解物。超声波处理（7micros30秒4次，每次间隔1分钟），4℃，离心，转速为12000rpm，取上清，测定蛋白含量。

　　1.2.2　组织蛋白的提取鼻咽癌活检组织取出后，在冰浴下用玻璃研磨器磨碎标本，然后加入细胞裂解液裂解细胞，超声波处理（7micros30秒4次，每次间隔1分钟）离心，取上清，测定总蛋白含量。

　　1.2.3　免疫沉淀用OncogeneScience公司p53单克隆抗体，根据抗体说明进行标本处理。p53抗体15μl与细胞裂解物1ml进行免疫沉淀。p53抗体是一种与ProteinAagarose结合的小鼠抗p53单克隆抗体，可把裂解物中的p53抗原沉淀，形成抗原抗体复合物。沉淀物经洗涤后加上样缓冲液（Samplebuffer），然后用于Westernblot。

　　1.2.4　Westernblot已溶解于上样缓冲液的沉淀物在15％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至硝酸纤维膜上，用1:30稀释p53抗体（小鼠单克隆抗体）进行Westernblot，然后用1:300稀释的二抗（碱性磷酸酶联羊抗小鼠IgG）处理，采用DAB显色试剂盒检测、摄影。

　　2　结果

　　2.1　鼻咽癌细胞株Westernblot结果

　　7株鼻咽癌细胞株均出现p53蛋白表达异常条带。而且HNE₁和HK₁细胞株除出现p53蛋白突变条带外，还出现一条微弱的额外带（见图1）。

M为蛋白分子量标准，1HNE₁，2HNE₂，3、9正常组织对照，

　　4 HNE₃,5 CNE₁,6 CNE₂－Z,7 SUNE₁,8 HK₁

1　鼻咽癌细胞株Western blot结果

　　2.2　鼻咽癌组织Westernblot结果

　　鼻咽癌104例标本中，有12例出现p53蛋白表达异常的条带（见图2），检出率为11.54％。鼻咽慢性炎症8例标本中p53蛋白表达均未见异常。

M为蛋白分子量标准，1～9鼻咽癌标本，

　　3、4、6、8、9鼻咽癌p53突变，10正常对照图2　鼻咽癌组织Western blot结果

　　2.3　鼻咽癌p53蛋白的异常表达与病理类型和临床分期的关系

　　12例出现p53蛋白异常表达的标本，病理诊断均为鼻咽低分化鳞癌。104例鼻咽癌标本中包括了Ⅰ～Ⅳ期的患者。出现p53蛋白异常表达的12例标本中Ⅰ期为1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期5例，Ⅳ期2例，另外有1例分期不明（附表）。

附表　鼻咽癌p53蛋白异常表达者临床分期和IgA/VCA和IgA/EA的状况

　　2.4　p53蛋白异常表达与EB病毒感染的关系

　　12例p53蛋白表达异常者，除1例确诊鼻咽癌后不在本院治疗，未做EBVIgA/VCA和IgA/EA抗体检测，其余11例IgA/VCA抗体滴度均阳性，抗体滴度除1例为1:40，1例为1:160，其余9例≥1:320。IgA/EA抗体滴度除1例阴性，其余10例均阳性（附表）。

　　2.5　鼻咽癌p53蛋白表达异常与预后的关系本文研究的104例鼻咽癌患者中，发现有2例患者复发。这2例患者均为p53蛋白表达异常。其中1例为Ⅱ期患者，放疗结束后14个月复发。另外1例为Ⅳ期患者，放疗结束后10个月复发。追踪观察患者1～2年所研究的104例鼻咽癌患者均未发现有肿瘤转移。

　　3　讨论

　　p53参与正常体细胞周期的调控，限制细胞成长分裂，在细胞周期和细胞凋亡过程中发挥重要作用^[2]。为了观察鼻咽癌细胞株p53基因的表达情况，本文对7株人鼻咽癌细胞株进行研究，结果表明7株均有不同程度的p53蛋白异常表达，HNE1和HK1细胞除出现p53蛋白条带外，还出现一条微弱的条带。我们所检测的鼻咽癌组织中有部分也在这个位置上出现一条额外条带。p53蛋白编码子氨基酸突变可见一个等位基因突变，另一等位基因缺失或是功能失活，还可出现p53二个等位基因都突变。研究中所见的额外条带是否也是突变型p53等位基因的表达，有待进一步研究。鼻咽癌的发生、发展与EB病毒感染相关，为了了解p53基因与EB病毒的关系，本文研究了鼻咽癌患者p53蛋白表达与EBV感染的关系。研究表明p53蛋白表达异常者大多数其IgA/VCA和IgA/EA均为阳性，而且IgA/VCA抗体滴度相当高，说明p53蛋白异常表达者大多数感染了EB病毒。迄今已发现许多恶性肿瘤存在p53基因突变，但不同肿瘤有不同的表型及突变率^[1,3]。本文对临床怀疑鼻咽癌，但病理确诊为鼻咽粘膜慢性炎症患者标本进行了p53蛋白检测未发现有异常表达现象。但在检测鼻咽癌标本中，则发现鼻咽癌p53蛋白表达异常占11.54％。本研究还表明鼻咽癌患者不仅在晚期（Ⅲ、Ⅳ期）有p53蛋白异常表达，而且在早期（Ⅰ、Ⅱ期）也有p53蛋白异常表达现象存在。但从初步的实验结果表明，鼻咽癌患者p53蛋白的异常表达多见于恶化程度较高，分期较晚，IgA/VCA高滴度和IgA/EA阳性的病例，但尚未发现p53蛋白异常表达与病程进展的关系^[4]。有文献报道^[5]鼻咽癌中p53基因突变率很低，在原发癌中小于10％。本文所研究的104例鼻咽癌均为原发癌，p53蛋白异常表达检出率（12/104）为11.54％，比上述文献报道稍高些。可能与我们采用Westernblot结合免疫沉淀技术对提高p53蛋白异常表达的检出率有一定的关系。特别值得注意的是，在我们所检测的104例鼻咽癌活检组织中，追踪观察发现仅有2例复发病例，而且均为p53蛋白的表达异常者，其余p53蛋白的表达未见异常的鼻咽癌病例均未发现有复发现象，表明p53基因突变可能与鼻咽癌预后有一定关系，说明p53蛋白异常表达与鼻咽癌发生、发展有一定的关系。

　　*本文课题受美国中华医学基金会(CMB)赞助

　　作者单位：郑美莲　区宝祥　龙江斌　邓满泉　陈丽珍　梁启万　邝珠玑　李辉梅　中山医科大学肿瘤防治中心　广州市510060

　　参考文献

　　1　Hollstein M,Sidransky D,Vogestein B,et al. p53 mutation in human cancer. Science,1991;253:491

　　2　Dahiya R,Deg G,Chen KMK,et al. p53 tumor－ suppressor gene mutations are mainly localized on exon 7 in human primary and metastatic prostate cancer. Br J Cancer,1996;74(2):264～ 8

　　3　Gimenez－ Conti IB,Collet AM,Lanfranchi H,et al. p53 Rb and cyclin D1 expression in human oral verrucouse carcinoma. Cancer,1996;78(1):17

　　4　Gan H,Wang LA,Zhou Q,et al. p53 tumor suppressor gene mutation in early esophageal precancerous lessions and carcinoma among high－ risk population in human China. Cancer Res,1994;54:4342

　　5　Smith DR,Ji CY,Goh HS. Prognostic significance of p53 overexpression and mutation in colorectal adenocarcinomas. Br J Cancer,1996;74(2):216