恶性骨肿瘤热疗温度初探
中华骨科杂志 1999年第3期第19卷 基础研究
作者：郑联合 范清宇 裘秀春 马保安 蒋维中 曹秀堂
单位：郑联合、范清宇、裘秀春、马保安、蒋维中 710038西安，第四军医大学唐都医院骨科；曹秀堂 第四军医大学统计教研室
关键词： 骨肉瘤；高温；诱发；温度
【摘要】目的 确定恶性骨肿瘤(成骨肉瘤)的热疗最佳温度与时间。方法 采用临床新鲜成骨肉瘤标本20例与成骨肉瘤培养细胞,不同温度不同时间作用后,观察细胞活性，进行电镜、光镜、免疫组化检查。结果 45℃作用30分钟85％的成骨肉瘤细胞死亡，50℃作用30分钟全部肿瘤细胞即时死亡,电镜下组织标本呈现不可逆性破坏,免疫组化抗原大部分保存完好,大于50℃则抗原明显减弱,大于70℃则抗原逐渐消失。结论 50℃30分钟可作为成骨肉瘤热疗温度、时间。
A Preliminary Experimental Study on Optimum Hyperthermic Temperature for the Treatment of Osteogenic Sarcoma
ZHENG Lianhe, FAN Qingyu, QIU Xiuchun, et al.
Department of Orthopaedics, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University,Xi’an 710038
【Abstract】Objective To determine the optimum temperature for hyperthermic treatment of osteogenic sarcoma.Methods The living cells and fresh tumor samples of osteogenic sarcoma were heated in vitro at different temperatures for different time intervals. The cell living test, electron and light microscopy, immunohistological stain were used to inspect these samples.Results After heated at 45 ℃ for 30 minutes, 85％ of the osteogenic sarcoma cells were killed, and heated at 50 ℃ for 30 minutes, 100％ of the cells were killed, the osteogenic sarcoma morphology showed irreversible damage under electron microscope. Above 50 ℃ heating the osteogenic associated antigens decreased obviously and above 70 ℃ heating the osteogenic associated antigens disappeared nearly completely.Conclusion 50 ℃ for 30 minutes seemed to be the optimum temperature and time of the osteogenic sarcoma thermotherapy.
【Key words】 Osteosarcoma Hyperthermia, induced Temperature
近年来,高温治疗恶性肿瘤的应用达到了一个新的高潮,人们逐渐认识到在肿瘤热疗中免疫系统的反应对杀灭肿瘤所起的作用。关于肿瘤热疗的免疫作用,人们过多地关注于：(1)肿瘤热疗后肿瘤变性蛋白刺激机体的免疫系统，(2)热疗后肿瘤细胞抗原性增加。关于肿瘤热疗合适温度的报道甚少,如果温度太高,抗原破坏大,提高免疫力不明显;温度过低杀不死瘤细胞,术后易复发。如何选择一个合适的温度,将肿瘤彻底杀死,而抗原性又保存完好,我们力图从这一方面做一些粗浅的工作,给临床提供一些有益的参考。
材料与方法
一、实验标本、材料、试剂与仪器
临床新鲜手术标本20例,术中冰冻及术后常规病理检查为成骨肉瘤。肉瘤细胞系我室传代培养的成骨肉瘤细胞,其它包括：ABC试剂盒(Pierce,USA),Vimentin鼠抗1∶50（ZYMED）,ALP羊抗1∶50(DAKO),PCNA鼠抗1∶50(ZYMED)，BMP鼠抗1∶100（第四军医大学口腔医院病理科），HLA－α鼠抗1∶200（第四军医大学免疫教研室）,SP试剂盒(中山生物技术公司),恒温水浴箱(英国)。
二、实验方法
(一)将传代培养的成骨肉瘤细胞,酶消化后制成细胞悬液,分别设立正常对照。42℃30分钟,45℃30分钟,50℃30分钟水浴作用后,放离心管1000转/分,5分钟沉淀细胞,弃上清加等体积5×10－3mol/L台盼蓝(PBS稀释)作用5分钟后,吸管吸出,涂片,每高倍镜下做死亡细胞计数，细胞着蓝色表示细胞膜破坏、细胞死亡。
(二)将新鲜肿瘤标本同一部位取材后,分成大小均匀的1mm×3mm×3mm小块密闭置于恒温水浴加热箱中，调温30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃分别加热10分钟、30分钟、50分钟。（1）分取上述各温度、时间标本,甲醛固定,酒精脱水,石蜡包埋,行HE染色。（2）上述各石蜡包埋块,5μm切片分别行Vimentin、PCNA、ALP、HLA－α、BMP免疫组化染色,其中ALP为SP法,余为ABC法。观察部位:背景好,染色清晰。每个标本设正常阳性、阴性对照。
(三)分取同一部位新鲜肿瘤组织,约1mm×1mm×1mm大小，经42℃30分钟,45℃30分钟,50℃30分钟,60℃30分钟,70℃30分钟,80℃30分钟,90℃30分钟作用后放入0.5mol/L戊二醛固定液中,行电镜检查。
结果
一、HE染色
在不同时间、不同温度作用后,可以看出50℃作用后光镜下出现明显的细胞核浓染,但细胞形态完整,整个HE结果未见实质性改变(图1)。
1 成骨肉瘤新鲜标本50℃30分钟加热，光镜下可见核固缩,但细胞形态完整 HE×360
二、细胞活性检查结果
1.正常肿瘤细胞：台盼蓝染色率为0（图2）。
图2 正常成骨肉瘤细胞,台盼蓝染色全部呈无色阴性反应 台盼蓝染色×360
2.加热42℃30分钟组：肿瘤细胞台盼蓝染色率为14％～18％（图3）。
3 成骨肉瘤细胞42℃30分钟作用后,部分细胞台盼蓝染色呈蓝色阳性反应(箭头所示) 台盼蓝染色×360
3.加热45℃30分钟组：肿瘤细胞台盼蓝染色率为80％～96％。
4.加热50℃30分钟组：肿瘤细胞台盼蓝染色率为100％(图4)。
图4 成骨肉瘤细胞50℃30分钟作用后,台盼蓝染色全部呈蓝色阳性反应 台盼蓝染色×360
三、电镜结果
1.正常对照：胞核、胞膜完整,细胞器清晰,可见核分裂相(图5)。
5 正常成骨肉瘤细胞,可见细胞核、细胞膜完整,胞浆内细胞器清晰可见 透射电镜×7500
2.42～45℃30分钟组：可见核明显固缩,但胞核、胞膜完整(图6)。
图6 成骨肉瘤组织45℃30分钟作用后,可见细胞核明显固缩(箭头所示) 透射电镜×7500
3.50℃30分钟组:可见核破坏、淡染、胞膜破坏,形态上显示不可逆性变化(图7)。
7 成骨肉瘤组织50℃30分钟作用后,可见胞膜破坏,胞浆内细胞器消失,胞核部分溶解,形态上显现不可逆性破坏(箭头所示) 透射电镜×7500
4.60℃30分钟组:可见细胞形态部分消失,胞浆内一片透明,镜下一片废墟。
四、免疫组化结果
采用部分对数线性模型拟合免疫组化结果(表1)。
表1 免疫组化结果
| 应变量 |
参数名 |
估计值 |
标准误 |
u值 |
P值 |
| HLA－α |
60℃ |
1.4464 |
0.4715 |
3.0678 |
0.0022 |
| 30min*分值 |
0.1469 |
0.1568 |
0.9369 |
0.3488 |
| 50min*分值 |
0.2942 |
0.1547 |
1.9092 |
0.0572 |
| 60℃*分值 |
3.2797 |
0.5277 |
6.2153 |
0.0000 |
| PCNA |
50℃ |
1.2195 |
0.5331 |
2.2878 |
0.0221 |
| Vimentin |
50℃*30min |
－0.2164 |
0.4544 |
0.4763 |
0.6339 |
| 70℃*分值 |
5.3003 |
0.6394 |
8.2891 |
0.0000 |
| BMP |
50℃*分值 |
0.3886 |
0.6301 |
0.6160 |
0.5314 |
| ALP |
50℃*分值 |
2.8451 |
0.5299 |
5.3687 |
0.0001 |
注：*表示参数项联合作用，分值表示温度与时间线性分值的乘积，反映应变量变化趋势
讨论
肿瘤的热疗作用来源于德国文献记载的一个现象,一例严重丹毒患者的肿瘤症状明显减轻[1]。以后,人为的高热治疗肿瘤便在实验动物和患者身上开展起来。早先的试验,没有适宜的温控和恰当的测量,使临床成功的报道很少。最近的研究显示局部热疗在抗肿瘤方面有其优越性,如何选择一个合适的温度及作用时间是局部热疗抗肿瘤治疗的关键性问题。Fajardo等[2]1980年报告EMT－6种植裸鼠,制成肿瘤模型,射频治疗后5分钟、15分钟、30分钟、2.5小时、6.5小时、24小时、3天、7天处死动物取材,HE染色的组织切片结果提示43℃30分钟只杀灭18％的肿瘤细胞,44℃30分钟可杀死85％的肿瘤细胞。Overgaard等[3]1972年报告:40～44℃可杀死任何肿瘤,而对正常组织不会造成明显的伤害。许多学者就正常组织与恶性肿瘤对热的敏感性做了研究,认为恶性肿瘤细胞对热的敏感性高于正常组织[4]。Gerweck和Hahn等指出:组织中pH值下降,细胞环境中营养缺乏等因素是增强热所致细胞毒性作用的物质基础,恶性肿瘤细胞一般都有这些性质。由于肿瘤血流不同于正常组织,它急剧地变化肿瘤的pH值,减少组织的营养供给，与周围组织比较,它能诱导原位癌对热的敏感性。本实验用台盼蓝即时染色确定细胞加热后的活性结果表明，水浴加热成骨肉瘤细胞42℃30分钟可杀死18.2％肿瘤细胞,45℃30分钟却可上升到88.4％,50℃30分钟即时杀死全部肿瘤细胞。而电镜结果显示，42～45℃30分钟加热可见核明显固缩,但胞膜完整；50℃30分钟作用下可见核破坏、淡染，胞膜破坏,显示不可逆性变化；而60℃以上30分钟作用组,可见细胞形态部分或全部消失,胞浆内一片透明。因此50℃30分钟不论在形态上和细胞活性上皆可即时杀死肿瘤,反之50℃30分钟会不会造成肿瘤转移呢？目前公认的理论为，在加热治疗不能控制原发肿瘤时则肿瘤转移率高,当加热治疗完全控制原发肿瘤时,则肿瘤转移率低[5],50℃30分钟即时完全杀死肿瘤细胞，破坏其形态，而无需长期培养跟踪观察，足以控制原发肿瘤转移。
BMP、Vimentin、ALP、PCNA、HLA－α作为成骨肉瘤相关抗原已是不争的事实[6－8]。本实验采用部分对数线性模型拟合免疫组化结果表明,50℃基本上可作为抗原减弱的分水岭，50℃作用下各相关抗原性保存完好,唯有PCNA、ALP除外。对于ALP来说，50℃作用下抗原明显减弱(P＜0.01),70℃作用后抗原逐渐消失。对于HLA－α来说，60℃作用下抗原减弱明显(P＜0.01),50分钟作用时间下比30分钟作用下抗原结果减弱,但不明显(0.05)。对于PCNA来说,50℃作用下抗原出现明显破坏(P＜0.05),但抗原仍尚存,大于70℃抗原逐渐消失。对于BMP来说,受温度影响不大,各温度作用组差别无显著性意义,其中BMP90℃作用下才出现明显变化,100℃作用50分钟抗原仍存在。对于Vimentin来说,70℃作用组抗原出现明显变化(P＜0.01),100℃作用60分钟抗原仍存在。因此我们得出结论:50℃作用下各相关抗原并没有完全破坏,甚至有的抗原保存完好,另一方面从实验数据中可以看出,同一温度下不同时间作用后,作用时间越长抗原消失越多。又有文献报道[9,10],在50℃作用下BMP活性即骨诱导活性存在,一方面灭活后的瘤组织或局部切除后残留组织抗原可作为“瘤苗”刺激机体免疫力，另一方面没有破坏的骨诱导活性又可以促使骨骼外软组织中的间充质细胞分化成为骨祖细胞,进而分化为软骨细胞、骨母细胞和骨细胞,在局部形成具有骨包膜、骨髓组织的典型结构,加速骨损伤处的修复。又有大量的文献报道：(1)骨基质中含有很多抗原,胶原及非胶原就是弱抗原；(2)骨髓组织中存在大量的成骨因子,能促进生骨细胞的分化发育，形成新骨；(3)骨基质中的粘合素、板层素、透明质酸及蛋白多糖都能影响生骨细胞的生物合成，并可通过化学动力性与趋化性加速细胞的相互移位，参与骨修复。如果温度太高,抗原破坏大,骨诱导活性丧失,骨损伤重,修复慢，临床恢复晚[11]；反之肿瘤易复发。综上所述,本体外实验结果显示，50℃30分钟是最佳局部成骨肉瘤的热疗温度、时间。
参考文献
1 Burger FJ, Fuhrman A. Evidence of injury by heat in mammalian tissues. Am J Phys,1964,206:1057－1061.
2 Fajardo LF, Egbert B, Marmor J, et al. Effects of hyperthermia in a malignant tumor. Cancer,1980,45:613－623.
3 Overgaard K,Overgaard J. Investigation on the possibility of a thermic tumour therapy Ⅱ . Actoin of combined heat－roentgen treatment on a transplanted mouse mammary carcinoma. Eur J Cancer,1972,8:573－575.
4 郑联合，范清宇，刁亚英.微波高温治疗恶性骨肿瘤的新思考.医学与哲学,1997,18:207－208.
5 谷铣之,殷蔚伯,刘泰福,等.肿瘤放射治疗学.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1993.333.
6 金岩,杨连甲.颌骨骨肉瘤中骨形成蛋白的免疫组化定量分析.中华口腔医学杂志,1991,26:276－278.
7 董书坤,刘子君.常见骨肿瘤细胞化学的初步观察.中华骨科杂志,1986,6:53－55.
8 王东,高奉浔.增殖细胞核抗原与骨肉瘤预后的关系.中华病理学杂志,1995,24:55－56.
9 Nelson CG, Krishnan EC, Neff JR. Consideration of physical parameters to predict thermal necrosis in acrylic cement implants at the site of giant cell tumor of bone. Med Phys,1986,13:462－468.
10 Kuhne JH, Bartl R, Hammer C, et al. Moderate heat treatment of bone allografts: experimental results of osteointegration. Arch Orthop Trauma Surg,1992,112:18－22.
11 郑联合,范清宇,马保安,等.微波灭活犬骨修复的实验研究.第四军医大学学报,1997,18:274－277.
(收稿：1998-05-11修回：1999-01-07)
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