nm23-H1抑制原发性肝癌细胞转移的初步机理研究

中国普外基础与临床杂志 1999年第5期第6卷 基础与实验研究

作者：张开泰　王玉芝　韩本立

单位：张开泰　王玉芝　军事医学科学院二所四室(北京　100850)；韩本立　第三军医大学西南医院肝胆外科

　　关键词： 原发性肝癌；浸润；nm23-H1基因

　　摘要　为了更深入阐明nm23-H1抑制原发性肝癌转移的作用机理，观察nm23-H1表达状况对肝癌细胞浸润相关因素的影响，本实验采用基因转染手段，将外源nm23-H1全长cDNA导入肝癌细胞并以此观察细胞体外浸润能力、细胞内游离Ca²⁺以及N-ras基因mRNA表达的变化。结果： nm23-H1转染组发生侵袭的癌细胞数下降(P＜0.05)； N-ras mRNA丰度明显降低(P＜0.05)； 细胞内游离Ca²⁺浓度增高(P＜0.05)。结果提示： nm23-H1影响原发性肝癌细胞浸润与转移可能是通过调节癌细胞内的信息传导而实现的。

A PRIMARY EXPERIMENTAL STUDY OF SUPPRESSIVE EFFECTS OF NM23-H1 ON METASTASIS OF PRIMARY HEPATOCELLULAR CARCINOMA CELLS

Zhang Kaitai, Wang Yuzhi, Han Benli.

　　Institute of Beijing Radiation Medicine, Beijing 100850

　　Abstract　For an advanced elucidation of mechanisms of nm23-H1 suppressive effects on metastasis of primary hepatocellular carcinoma (HCC), it is necessary to investigate the correlation between nm23-H1 expression and relative factors involved in the HCC invasion. In present report, full-length cDNA of nm23-H1 was subcloned into pBKCMV vector and transfected into HCC cell line to observe its effects on invasion, cytosolic free Ca²⁺ and N-ras mRNA expression. The results showed that lower expression of N-ras and higher cytosolic free Ca²⁺ in transfected cell line were detected, while the potential of invasion was depressed. It suggests that the suppressive effects on HCC metastasis might interact with intracellular signal transduction which is essential for stimulating cell invasion.

　　Key words　　Primary hepatocellular carcinoma　　Invasion　　nm23-H1 gene

　　原发性肝细胞癌浸润与转移能力与nm23-H1的异常表达密切相关。动物实验表明，提高nm23-H1在癌细胞中的表达可抑制肝癌细胞的肝内浸润与转移。然而，产生这一生物学功能的内在机理尚不清楚。鉴于nm23-H1的蛋白产物为磷酸二激酶，可能参与细胞的信号传导过程，因此本实验拟通过基因转染技术，在nm23-H1不同表达情况下观察原发性肝癌细胞体外侵袭力、细胞内游离Ca²⁺以及N-ras基因mRNA表达的变化，以对nm23-H1抑制肝癌细胞浸润与转移的机理进行更深入的探索。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　nm23-H1全长cDNA及原发性肝癌细胞株PLC/PRF由军事医学科学院王玉芝教授馈赠。pBKCMV真核表达载体购自美国Stratagene公司。Multi-Transwell培养板购于美国Sigma公司。

　　1.2　nm23-H1转染阳性克隆筛选及肝癌细胞培养

　　nm23-H1 cDNA亚克隆至pBKCMV载体，脂质体包裹后转入原发性肝癌细胞，G418筛选阳性克隆。肝癌细胞共分为转染nm23-H1 cDNA组(nm23-H1组)、转染pBKCMV空载体组(pBKCMV组)和空白对照组3组。每组10个样本，每个样本复种3孔。

　　1.3　mRNA表达丰度的定量分析

　　采用逆转录酶联聚合反应(RT-PCR)转录mRNA，同时掺入内参照引物β-actin，使目的基因与内参照基因一起被转录，1.5%凝胶电泳，凝胶成像系统计算积分光密度。

　　1.4　细胞内游离Ca²⁺检测

　　采用乙酸羧甲基脂(Fura-2/AM)荧光掺入法^〔1〕。收集细胞1×10⁶个，重悬并加入Fura-2/AM， 37℃震荡40分钟，离心(1 000 r/min)5分钟，去除细胞外荧光素。RF-540荧光分光光度计(日本岛津)读取光度值并计算游离Ca²⁺浓度。

　　1.5　肝癌细胞侵袭实验

　　癌细胞侵袭力检测采用Multi Transwell培养系统。将含有趋化因子的细胞培养液加入到Multi Transwell培养孔的下室，取各组细胞悬液1×10⁶个置于上室。上下室间隔以12 μ聚碳酸酯膜(不含聚乙烯吡咯酮烷)，膜的上室面包被Metrigel胶。37℃培养8小时，收集穿透到下室的细胞并计数。

　　1.6　统计学处理

　　结果以±s表示。采用美国数据分析系统(SAS)进行方差分析，P＜0.05为统计学差异显著。

　　2　结果

　　2.1　nm23-H1对N-ras基因表达的影响

　　pBKCMV组和空白对照组nm23-H1 mRNA表达丰度非常低，而N-ras基因mRNA表达丰度较高； nm23-H1组nm23-H1 mRNA表达丰度较高，N-ras mRNA丰度明显低于其他两组(见表1，图1)。

表1　nm23-H1对N-ras mRNA表达的影响(±s)

　　与其他两组比较， *P＜0.05

图1　N-ras mRNA丰度电泳结果

　　A、B： pBKCMV组； C、D： 空白对照组； E、F： nm23-H1组

　　2.2　nm23-H1对细胞内游离Ca²⁺的影响

　　pBKCMV及空白对照组癌细胞内游离Ca²⁺浓度分别为64.7±7.3 mmol/L和68.4±6.6 mmol/L，nm23-H1组为188.5±10.9 mmol/L，后者明显高于前两组(P＜0.05)，见表2。

　　2.3　nm23-H1对癌细胞侵袭力的影响

　　pBKCMV和空白对照组癌细胞发生侵袭的细胞数分别为610.6±39.7个/孔和657.4±50.4个/孔，nm23-H1组则为527.2±45.9个/孔，明显低于前两组(P＜0.05)，见表2和图2。

表2　nm23-H1对肝癌细胞游离Ca²⁺及侵袭力的影响(±s)

　　与其他两组比较， *P＜0.05

图2　发生侵袭的原发性肝癌细胞，箭头示聚碳酸酯膜滤孔　×200

　　3　讨论

　　nm23-H1蛋白产物二磷酸核苷激酶(NDPK)属于磷酸转移激酶，其主要功能是维持细胞内NTP池的平衡： N1TP+N2DP＝N1DP+N2TP(N1、N2表示两种核或脱氧核苷酸)。近年通过X射线衍射结构分析发现，在NDPK表面存在丝氨酸磷酸化位点^〔2〕，说明NTP池的平衡是通过丝氨酸磷酸化后能量改变使磷酸根发生转移而得以维持的。NTP池的平衡与G蛋白循环有关，因此有学者推测nm23-H1控制肿瘤细胞转移行为可能是由于影响了G蛋白循环以及其他有关的信息传导途径。G蛋白由3个亚基α、β、γ组成，受细胞外刺激信号的作用脱掉β、γ亚基，并与GTP结合从而形成有活性的G蛋白，并将信息传递给后继的效应因子。当GTP水解成GDP同时再结合β、γ亚基时，G蛋白便失去活性，信息传导中断。此外，在NDPK表面还发现了与cAMP的结合位点。而且NDPK与cAMP结合后并不影响其磷酸根转移活性，提示NDPK存在与磷酸转移功能不相关的其他生物学功能^〔3〕。

　　本实验结果显示，N-ras基因的表达受nm23-H1的影响； 提高nm23-H1表达可提高细胞内游离Ca²⁺浓度。N-ras基因产物p21蛋白即为G蛋白。在原发性肝癌中由于N-ras基因其常在61位点产生突变，故使p21蛋白呈现持续高表达。nm23-H1调节N-ras基因的表达，提示nm23-H1可能直接或间接地参与了由N-ras基因所介导的信息通路。细胞内游离Ca²⁺是细胞信息传递的第二信使，参与众多的信息传导过程，对肿瘤的转移具有重要意义。资料表明，在具有转移特征的癌细胞中，游离Ca²⁺下降是导致癌细胞侵袭力增强的较为主要的原因之一^〔4〕。

　　综上述，nm23-H1影响原发性肝癌细胞的转移特性，可能是通过调节癌细胞内的信息传导而实现的。具体而言，究竟是通过哪一条信息通道尚不清楚，G蛋白循环、cAMP以及Ca²⁺在nm23-H1介导的信息通路中的相互关系也值得更进一步研究。

　　参考文献

　　1　Seishima M, Esaki C, Osada K. Pemphigus IgG, but not bullous pemphigoid IgG, causes a trasient increase in intracellular calcium and inositol 1,4,5-triphosphate in DJM-1 cells, a squamous cell carcinoma line. J Invest Dermatol, 1995; 104(1)∶33

　　2　Munoz Dorado J, Almaula N, Inouye S. Autophosph-orylation of nucleoside diphosphate kinase from myxococcus xanthus. J Bact, 1993; 175(4)∶1176

　　3　MacKonald NJ, De La Rosa A, Benedict M. A novel phosphorylation of nm23, and not its nucleoside diphophate kinase actinity, correlates with suppression of tumor metastasis. J Biol Chem, 1993; 269(13)∶25780

　　4　Fuller LC, Allen MH, Montesu M. Expression of E-cadherin in human epidermal non-melanoma cutaneous tumors. Br J Dermatol, 1996; 134(1)∶28

(1998-07-05收稿，1999-05-20修回)