单纯疱疹病毒胸苷激酶基因通过前药转换作用特异性杀伤大肠癌组织细胞的实验研究

中华外科杂志 1998年第11期第36卷 论著摘要

作者：崔龙　王元和　林言箴　曹广文　屠岳　孟荣贵　高军　曲乐丰　戚中田

单位：200433 上海，第二军医大学附属长海医院普通外科（崔龙、屠岳、孟荣贵、曲乐丰）；第二军医大学附属长征医院普通外科（王元和），第二军医大学基础医学部微生物学教研室（曹广文、高军、戚中田）；上海第二医科大学附属瑞金医院外科（林言箴）

　　我们将大肠癌特异性CEA基因转录调控序列插入到单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因前来驱动该基因在肿瘤组织中靶向表达，观察其肿瘤杀伤效果。

　　1．材料和方法：(1) 基因转染: 逆转录病毒载体包装、病毒上清收集及滴度测定参照经典方法进行。(2)前药无环鸟苷(ACV)对转基因大肠癌细胞的杀伤作用及测定：将转染LNtk、G1CEAtkNa成功基因之LoVo细胞及未转基因之LoVo细胞以2.0×10⁴/孔接种到96孔细胞培养板中, 接种同时加入含各种梯度浓度的前药ACV进行培养，8天后去除培养液,以MTT法测定活细胞比率并计算各孔细胞生长率。将转G1CEAtkNa 基因的LoVo细胞与未转基因之LoVo细胞分别以100%、50%、30%、20%、10%、0之比率混合接种至24孔板中,以1.0 mg/ml ACV 的1640完全培养基培养8天后, 以MTT法检测活细胞比率并计算杀伤率。(3)肿瘤模型的建立及前药抑瘤实验:将4周龄之BALB/C裸鼠38只随机分成4组, 将转染成功LNtk、G1CEAtkNa之LoVo细胞及未转基因的LoVo细胞以1.2×10⁶分别接种到裸鼠大腿皮下。第1、2组动物均于一侧接种不同转tk基因的LoVo细胞，对侧接种未转基因的LoVo细胞；第3组动物一侧接种G1CEAtkNa之LoVo细胞，另一侧接种含LNtk基因的LoVo细胞；第4组两侧均接种未转基因的LoVo细胞。所有动物2周后均已成瘤，即开始治疗。1、2、3组动物分别每日腹腔注射500 mg/kg的ACV，连续给药50天，第4组动物则予以生理盐水治疗。所有动物每5天测量1次肿瘤体积并以相应公式计算肿瘤重量。在前药治疗结束后处死动物，将肿瘤标本以福尔马林脱水，石蜡包埋制作切片，经HE染色后在显微镜下观察肿瘤病理学变化。

　　2．结果：（1）逆转录病毒包装收获的病毒上清的病毒滴度： 3种逆转录病毒滴度分别为：G1Na载体1.7×10⁵ CFU/ml，LNtk载体1.0×10⁵ CFU/ml，G1CEAtkNa载体1.4×10⁴ CFU/ml。（2）前药ACV对转基因的人大肠癌细胞的杀伤作用：转普通型及组织特异型tk基因后的LoVo细胞较未转基因之LoVo细胞对ACV的敏感度增强有显著意义(P＜0.01，n=9),而转染组织特异型tk基因的LoVo细胞较转LNtk基因的LoVo细胞对ACV的敏感度有显著意义增强(P＜0.01，n=9)，其半抑制浓度（IC₅₀）分别为0.1 mM及0.3 mM。旁观者效应结果为：LoVo混合细胞在ACV作用下按其混合接种比率100%～0的杀伤率依次为: 98.1%、90.1%、86.4%、79.6%、39.9%、0.0。（3）前药抑瘤作用：转基因成功后，予以前药ACV进行治疗。与对照组比较，转LNtk基因的肿瘤在前药ACV作用下表现出明显的肿瘤抑制作用(P＜0.01，n=10)，转G1CEAtkNa基因的肿瘤受抑制程度显著大于转LNtk基因的肿瘤(P＜0.01，n=10)；对照组肿瘤的生长未受明显影响。肿瘤切片镜下观察发现,对照组肿瘤细胞大部分生长活跃并可见核分裂相；而转基因组肿瘤标本内可见大片空泡变性区,特别是转G1CEAtkNa基因的标本内,瘤细胞几乎全部消失,仅可见散在的成纤维细胞及炎性细胞。

　　3．讨论：近年来有报道将自杀基因(HSV-tk, CD)转导入肿瘤细胞中表达, 观察到明显的前药转换肿瘤杀伤效应。肿瘤基因治疗的关键是目的基因的转染效率及持续稳定表达。对于自杀基因来说, 应强调其定向性表达, 否则同样会使正常细胞死亡从而产生与临床上放疗、化疗相类似的毒副作用。Scharfmann等认为,“持家基因” 的转录调控序列可使外源基因在某组织中持续高水平表达。CEA基因属于“持家基因”，许多大肠癌，特别是中晚期大肠癌细胞，其CEA基因又重新开放表达。在本研究中，我们首先构建了以CEATRS调控tk基因的大肠癌组织特异性逆转录病毒载体G1CEAtkNa,然后将普通型LNtk基因和组织特异性G1CEAtkNa基因在大肠癌LoVo细胞中表达,观察到转基因细胞的前药转换抑瘤效果较未转基因LoVo细胞显著增强(P＜0.01);同时，在CEA高分泌的LoVo细胞中,以CEA转录调控序列调控tk基因表达的前药转换抑瘤IC₅₀值较LTR调控tk基因表达的IC₅₀值高3倍,体现了明显的组织特异性肿瘤杀伤效果。另外, 自杀基因在大肠癌细胞中的定向表达, 不仅使无细胞毒的ACV可以大剂量应用来直接杀伤肿瘤细胞, 而且tk自杀基因有较强的“旁观者效应”,更增加了抗肿瘤效果。本研究显示,在前药ACV作用下,只要含20%的转基因大肠癌细胞,混合大肠癌细胞就可大部分被杀死(79.6%)。ACV对转组织特异性tk基因肿瘤的杀伤作用明显高于转非组织特异性肿瘤，提示：如果利用此负选择系统来定向性杀灭那些未切除干净的残留瘤灶及微小转移灶，可望达到肿瘤根治的目的。

　　注本课题受国家自然科学基金资助

（收稿：1997-10-10　修回：1998-03-14)