肺癌组织9p21区域杂合性缺失和p16基因异常的分析＊
中国肿瘤临床1999年第26卷第7期
王兴元 孙燕 李卫东 王秀琴 程金科 吴旻
摘 要 目的:研究肺癌组织9p21杂合性缺失和p16基因的变化。方法:49例肺癌组织和相应的16例转移性肺门淋巴结RNA进行RT－PCR和SSCP分析，对其中38例肺癌组织DNA进行杂合性缺失分析(9S171和IFNA两个位点)。结果:9p21区域杂合性缺失频率：47.3％(18/38)。D9S171和IFNA位点杂合性缺失频率分别为：26.3％(10/38)和36.8％(14/38)。原发灶和转移性肺门淋巴结p16基因cDNA缺失率分别为：36.7％(18/49)和56.2％(9/16)，两者统计学无显著差异。p16基因cDNA缺失率在低分化组高于中或高度分化组，两者具有显著性差异(P＜0.05)。p16基因表达缺失可能是早期事件p16基因异常的肿瘤细胞具有更加恶性的表型和行为，p16基因突变在肺癌发生、发展中不是主要的失活机制。
关键词：肺癌9p21 杂合性缺失 p16表达
肺癌组织频繁发生9p21的缺失[1]。1993年，Serrano[2]等在9p21区域发现一种新的抑癌基因，命名为p16，此基因编码16KD蛋白质。此蛋白可与CDK4和CDK6结合，抑制细胞进入S期，从而抑制细胞增殖，我们对49例肺癌组织和16例相应的转移性肺门淋巴结标本进行9p21杂合性缺失和此区域中抑癌基因－p16基因变化的分析，以期发现可能在临床应用的价值。
1 材料与方法
1.1临床资料
1996年11月～1997年2月中国医学科学院肿瘤医院49例手术切除的肺癌新鲜标本及16例相应转移性肺门淋巴结标本(其中4例小细胞肺癌和45例非小细胞肺癌)及相应的38例外周血标本，即置于液氮冻存。采用Trizo(GIBCO/BRL公司)提取总RNA。RNA－70℃冻存。38例肺癌组织及外周血标本，经常规蛋白酶K消化，酚－氯仿－异戊醇抽提。
1.29p21杂合性缺失分析
位于9p21的微卫星序列标志D9S171和IFNA(均购自ResearchGeneticsInc.)按文献[5]的方法进行PCR反应，8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染观察结果[3]。将肿瘤组织标本与其相应的外周血DNAPCR结果同时上样比较，若肿瘤的某一等位基因条带消失或相对密度减少50％以上，则记录为杂合性缺失；不同位点间杂合性缺失的差异采用χ2检验。
1.3RT－PCR
取1mg总RNA用SuperScript(GIBCO/BRL)试验盒进行逆转录反应；取1mlcDNA，分别加不同的引物，镁离子浓度1.5mmol/L，2.5mmol/L4×dNTPs，1UTaqDNA聚合酶，扩增p16基因时，反应体系中DMSO浓度为6％。为保证逆转录效率和确定cDNA的完整性，将β－actin做为参照。95℃预变性3分30秒，94℃50秒，55～62℃1分，72℃1分，35个循环后72℃延伸5分。将PCR产物10ml上样于1.5％琼脂糖凝胶(EB染色)，紫外线灯下观察电泳结果，拍照。引物序列：
β－actin:(F)5′CGTCTGGACCTGGCTGGCCGCGACC3′；(R)5′CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG3′；
p16(F)：5′－ATGATGATGGGCAGCGCC－3′,(R):5′CGAGGTTTCTCAGAGCCT－3′。
1.4SSCP
RT－PCR方法同前，PCR产物5ml加1ml变性上样缓冲液，95℃5分预变性，立即置于冰浴。其后将6ml产物上样于6％～8％非变性聚丙酰胺胶(含或不含10％甘油)。电泳条件：8W或20W，4℃或25℃，6～8小时。电泳后，进行银染拍照。
1.5统计学处理
采用χ2检验，确定样本差异。
2 结果
2.1肺癌原发灶9p21杂合性缺失与不同组织类型，分化程度的关系(附表，图1)
附表 肺癌组织和转移性肺门淋巴结9p21区域杂合性缺失和p16基因表达的分析
|
类别 |
9p21杂合性缺失 |
p16基因cDNA缺失 |
|
例数 |
例数(％) |
例数 |
例数(％) |
|
原发灶 |
38 |
18(47.3) |
49 |
18(36.7) |
|
小细胞肺癌 |
3 |
1(33.3) |
4 |
1(25.0) |
|
非小细胞肺癌 |
35 |
17（48.6） |
45 |
17(37.8) |
|
肺鳞癌 |
16 |
5(31.2) |
21 |
7(33.3) |
|
肺腺癌 |
10 |
7(70.0) |
13 |
6(46.2) |
|
肺泡癌 |
6 |
4(66.7) |
7 |
3(42.9) |
|
肺腺鳞癌 |
3 |
1(33.3) |
4 |
1(25.0) |
|
转移性肺门淋巴结 |
16 |
未做 |
16 |
9(56.2) |
图1 9p21区域LOH分析A：9S171位点B:IFNA位点T：肿瘤DNAB:外周血淋巴细胞DNA
9p21区域杂合性缺失频率：47.3％(18/38)。D9S171位点杂合性缺失频率为26.3％(10/38)，IFNA位点杂合性缺失频率为36.8％(14/38)。1/3例(33.3％)小细胞肺癌出现IFNA位点杂合性缺失。17/35例(48.6％)非小细胞肺癌发生9p21的杂合性缺失。非小细胞肺癌中，中度或高度分化组中杂合性缺失频率(36.8％，7/19例)低于低分化组(60％，6/10例)。
2.2p16基因外显子2－3表达与组织类型分化程度的关系(附表，图2)
a.M:PBR322DNA/HinfIdigest分子量标准
1－7：肺癌肿瘤组织标本箭头所示：β－actincDNA片段大小为600bp
作为p16基因逆转录的参照
b.M:PBR322DNA/HinfIdigest分子量标准
1－7：肺癌肿瘤组织标本箭头所示：p16exon2－3cDNA片段大小为350bp
标本2、5－7表达缺失
图2 p16基因外显子2－3片段表达分析
转移性肺门淋巴结p16基因外显子2－3cDNA缺失率(56.2％，9/16)高于原发灶缺失频率(36.7％，18/49)，两者无统计学差异。p16基因cDNA缺失率在非小细胞肺癌低分化组(8/13例，61.5％)明显高于中或高分化组(6/25例,24％)，两者具有显著性差异(P〈0.05)。
2.39p21杂合性缺失和p16基因cDNA缺失率与临床分期和吸烟史的关系
9p21杂合性缺失率：非小细胞肺癌，Ⅰ、Ⅱ期为57％(12/21例)，Ⅲ、Ⅳ期为58％(7/12例)；小细胞肺癌局限期0/2例，广泛期为1/1例。p16基因cDNA缺失率：非小细胞肺癌，Ⅰ、Ⅱ期为40％(12/30例)，Ⅲ、Ⅳ期为38％(5/13例)。小细胞肺癌局限期：0/3例，广泛期为1/1例。吸烟组中9p21杂合性缺失率和p16基因cDNA缺失率分别为：55.6％(10/18例)和41.7％(10/24例)；非吸烟组中9p21杂合性缺失和p16基因cDNA缺失率分别为：53％(9/17例)和36.8％(7/19例)。在合并肺门淋巴结转移组中9p21杂合性缺失率(10/19例，52％)和p16cDNA缺失率(43.5％，10/23例)虽高于无肺门淋巴结转移组(43.8％，7/16例；34.7％,8/23例)，两者无统计学差异。
2.4肺癌患者1年生存率随访
随诊49例中45例肺癌患者，9例肺癌患者死亡，其中4/9例(44％)出现p16基因cDNA缺失。
2.5SSCP结果
不同电泳条件下均未发现变异迁移带。
3 讨论
染色体9p21不仅在非小细胞肺癌，而且在小细胞肺癌均是主要的缺失区域[4]。本实验结果显示，18/38例(47.3％)肺癌原发灶出现9p21杂合性缺失。9S171与IFNA位点二者相距4cm，p16基因正位于两者之间。p16基因着丝粒侧的D9S171位点杂合性缺失频率：26.3％(10/38)，p16基因端粒侧的IFNA位点杂合性缺失频率：36.8％(14/38)。其中1/3例(33.3％)小细胞肺癌发生IFNA位点的杂合性缺失，而17/35例(48.6％)非小细胞肺癌发生一个或二个位点的杂合性缺失。本实验结果显示IFNA杂合性缺失频率较高，提示可能影响p16基因的结构和功能。本实验结果与先前文献报道比较[5]，9p21区域杂合性缺失发生率较低，推测可能由于新鲜肿瘤标本有部分正常组织细胞混杂，从而影响杂合性缺失分析结果。采用显微切割技术，有助于提高杂合性缺失的检出。
p16基因第2外显子是主要的缺失和发生突变的位点。先前报道中，肺癌组织p16基因突变率仅为0～8％[6]。本实验采用SSCP方法，检测p16基因外显子2－3cDNA片段，在不同的电泳条件下未发现变异迁移带。由于＞90％p16基因突变发生于外显子2以及SSCP方法和假阴性发生率〈10％，因而SSCP结果提示p16基因突变在肺癌的发生、发展中可能是少见的事件。
49例肺癌组织和16例转移性肺门淋巴结RNA的RT－PCR结果显示：18/49例(36.7％)原发灶和9/16例(56％)转移性肺门淋巴结出现p16基因exon2－3表达缺失。其中1/4例(25％)小细胞肺癌和17/45例(37.8％)非小细胞肺癌发生p16基因失表达。p16基因异常失活主要发生于非小细胞肺癌，p16基因失活主要发生于具有野生型Rb的肿瘤类型中[7]。本实验1例小细胞肺癌出现p16基因失表达是否属于具有野生型Rb基因尚需进一步研究。本实验显示发生9p21区域杂合性缺失的18例肺癌组织中有13例(61％)发生p16基因失表达。这个结果提示，9p21区域可能有其他抑癌基因的存在。
p16基因异常在肺癌的发生、发展过程中，是早期事件抑或晚期事件[8]。本实验同时分析相应的16例转移性肺门淋巴结RNA，9/16(56.2％)例p16基因失表达，高于原发灶p16基因表达缺失率，然两者统计学无显著性差异，而且p16基因失表达与临床分期无关，提示p16基因表达缺失可能为早期事件，p16基因失表达率在低分化组明显高于高或中度分化组，两者具有显著性差异，提示p16基因异常的肿瘤细胞亚群具有更加恶性的表型和行为。推测p16基因表达缺失的原因可能是p16基因纯合性缺失和p16调控区的甲基化，影响p16基因的表达。
RT－PCR从转录水平分析p16基因的表达水平，能反映p16基因调控区CpG岛甲基化对p16基因转录水平的影响，较免疫组化方法具有灵敏度的特点。结合微卫星DNA序列分析能较好反映基因组p16基因的变化。同时也不应忽视肺癌组织标本中有正常组织细胞存在，可能对RT－PCR结果分析有影响，影响p16基因失表达的检出。
对45例患者1年生存率的随访，9例死亡，其中4/9例(44％)死亡患者出现p16基因cDNA缺失，而12/36例(33％)生存患者出现p16基因cDNA缺失，p16基因异常是否可做为预后不良的生物学标志，尚需进一步扩大样本，进一步对患者进行3年、5年生存率的研究。
＊本文课题受国家攀登计划项目基金资助
作者单位：王兴元 孙燕 中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所肿瘤医院内科(北京市100021)
王秀琴 程金科 吴旻 李卫东 分子肿瘤学国家重点实验室
李卫东 美国宾夕法尼亚州立大学医学院
参考文献
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