利用巢式PCR检测肺癌组织的人类疱疹病毒6型

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第7期

吴一龙　李扬秋　黄植蕃　王思愚

　　关键词：人类疱疹病毒6型　CD4＋T细胞　肺癌组织　巢式PCR

　　人类疱疹病毒6型(HHV－6)是1986年由Salahuddin等从淋巴细胞增生疾病患者外周血单个核细胞中分离出的一种DNA病毒，是HHV的新成员之一。研究结果表明，HHV是一种多嗜细胞性病毒，主要靶细胞为CD4＋T细胞，它对机体的细胞免疫功能有一定影响。新的研究发现，HHV－6可能与某些人类肿瘤的发生有一定关系。本研究检测了50例不同病理类型的肺癌组织HHV－6的感染情况。

　　1材料与方法

　　1.1标本

　　50例手术切除的肺癌组织标本，按1986年UICC的病理学分型标准，其中鳞癌19例，腺癌15例，腺鳞癌7例，肺泡癌7例，大细胞癌1例，肺恶性神经鞘瘤1例。同时检测其中18例患者(包括鳞癌10例，腺癌5例，肺泡癌2例和腺鳞癌1例)的非肿瘤肺组织。从质粒中提取的HHV－6DNA(为德国柏林洪堡大学Virchow医院血液肿瘤内科SchmidtCA博士惠赠)作为阳性对照。

　　1.2方法

　　1.2.1肺癌组织DNA的提取取5～10μm厚度的石蜡切片组织，经二甲苯脱蜡，蛋白酶K(终浓度为500μg/ml)缓冲液消化(50℃)，加入酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合液提取DNA后，用乙醇沉淀，最后溶解于20μl的TE缓冲液中(10mmol/LTris－HCl，pH7.5；1mmol/LEDTA)，于－20℃保存备用。用PCR扩增β－干扰素基因作为检测DNA质量的指标，所提取的样品DNA均得到扩增产物。

　　1.2.2多聚酶链反应(PCR)从Lawrence等所报道的HHV－6的DNA序列中设计引物2对(外侧引物和内侧引物)。引物的序列如表1所示，由德国柏林TIB公司合成。PCR操作方法按Saiki等所报道的进行。第一次PCR总反应体积为25μl，其中含引物HHV－6－1/HHV－6－220pmol；dNTP(dATP，dCTP，dGTP及dTTP)各125μmol/L，2UTaq聚合酶，PCR缓冲液(10mmol/LTris－HCl，pH8.3；50mmol/LKCl；1.5mmol/LMgCl2；0.001％明胶)及2μlDNA样品。全部试剂为PerkinElmer公司产品。反应在PCR扩增仪(PerkinElmer公司产品)中进行。经92℃1分钟(首次为3分钟)变性后，于55℃1分钟退火，72℃1分钟合成(末次为10分钟)，共进行30循环后于4℃保存。所得产物于2.5％琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)中电泳分析结果。第2次PCR总反应体系同前，引物为HHV6－3/HHV6－4，模板为第1次PCR产物(1μ1),其它试剂同上。反应中退火温度为58℃，余条件同上。全部试验设阳性对照(HHV－6DNA)和阴性对照(不加模板DNA)。

　　2　结果

　　利用从HHV－6DNA序列所设计的一对外侧引物HHV－6－1/HHV－6－2进行首次PCR,扩增的产物为223bp的DNA片段，50例肺癌组织和18例非肿瘤肺组织标本均未检测到阳性产物。

表1　用于PCR扩增的HHV－6基因的引物序列

　　 利用内侧引物HHV－6－3/HHV－6－4进行第2次PCR，45例肺癌组织和其中相应的18例非肿瘤组织标本可检测到一132bp大小的DNA片段，不同病理类型肺癌阳性率见表2。

表2　肺癌组织石蜡切片HHV－6巢式PCR检测结果

　　3　小结

　　人类疱疹病毒6是一种线状双链DNA病毒，与许多疾病有关。研究表明，HHV－6能感染所有年龄组人群，也可感染许多细胞系，主要靶细胞是CD4＋细胞，与一些免疫系统疾病有关，也影响机体的细胞免疫功能，是近年来引人注目及正在研究的一个致病因子。

　　有报道在宫颈癌和鼻咽癌的组织石蜡切片中应用PCR方法检测到HHV－6DNA。本研究利用巢式PCR方法检测50例非小细胞肺癌组织石蜡切片中HHV－6DNA的存在情况，结果发现绝大多数病例(45/50)标本中存在HHV－6DNA，阳性率为90％。这一结果远远高于其他研究组关于宫颈癌(6/72)和鼻咽癌(5/34)阳性率的研究。这可能与本研究使用巢式PCR方法，提高了阳性标本的检出有关。本研究中，第1次PCR扩增均未能检出HHV－6DNA，经第2次PCR扩增，HHV－6DNA的检出率高达90％，提示标本中HHV－6DNA的含量很少，巢式PCR提高了检测的敏感性。另一方面，也可能与人种或病种的不同有关。

　　有关肺癌HHV－6DNA的检测，国内外均未有报道。本研究首次提供肺癌患者HHV－6感染的情况，结果提示绝大多数肺癌患者有HHV－6的感染。由于18例肺癌患者相应的非肿瘤组织可同时检测到HHV－6DNA，故推测本组研究病例HHV－6感染在肿瘤形成之前的可能性较大。多数学者认为HHV－6感染多发生于儿童期(2岁以前)，感染率可高达90％。该病毒潜伏于体内，在某种条件下(如免疫抑制)再次激活，这与本研究结果基本一致。至于HHV－6在肺癌形成过程中的具体作用尚不清楚。Chen等的研究证实了HHV－6能激活人乳头状瘤病毒转化基因，并证明感染了HHV－6的宫颈癌细胞能更快地在鼠身上诱发肿瘤生长。Kashanchi等发现HHV－6的一个功能区ORF－1不但可引起裸鼠的纤维肉瘤，而且同若干人类肿瘤如血管免疫母细胞性淋巴结病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤和恶性胶质瘤等有关，其机制是ORF－1蛋白抑制活化了的p53的转录。另一方面，HHV－6可感染CD4＋、CD8＋T细胞和NK细胞而引起机体免疫功能低下。这一切均提示，HHV－6感染可能与某些恶性肿瘤的发生有关。本研究发现在肺癌组织中存在HHV－6，是确定HHV－6在肺癌发生过程中作用的先决条件，这为探讨该病毒是否为肺癌的致病因子抑或为伴随感染，提供了进一步研究的线索。

　　作者单位：吴一龙　黄植蕃　王思愚　中山医科大学肿瘤医院胸科(广州市510060)

　　 李扬秋　暨南大学血液病研究室