人肺癌中蛋白激酶CβII的表达与细胞凋亡的相关性研究

　　CSCO2000年第四届学术年会

　　程玺 周清华 王允 张尚福 刘关键

　　摘　要 目的 探讨人非小细胞肺癌中蛋白激酶CβII的表达及细胞凋亡在肺癌发生、发展中的作用。 方法 应用免疫组织化学LSAB法和TUNEL法检测了119例人非小细胞肺癌组织，癌旁肺组织和32例肺良性疾病肺组织中PKC-βII的表达和凋亡细胞。 结果 （1）肺癌组织中PKC-βII表达水平(85.39%)显著高于癌旁肺组织(65.69%)和肺良性病变肺组织(53.22%)（P＜0.05），癌旁肺组织中PKC-βII表达水平显著高于肺良性疾病肺组织（P＜0.05）。肺癌组织中凋亡指数（5.27%）明显低于肺良性疾病肺组织（15.84%）(P＜0.05)。（2）肺癌组织中PKC-βII的表达水平与肺癌临床病理生理特征无明显关系（P>0.05）。肺癌组织的细胞凋亡水平与肺癌P-TNM分期，原发肿瘤大小（T）及淋巴结转移状态（N）有密切关系（P＜0.05），而与肺癌细胞分化程度、组织学类型，患者性别和年龄等均无明显关系（P>0.05）。（3）PKC-βII的表达水平与细胞凋亡水平呈显著负相关（P＜0.01）。结论 肺癌中PKC-βII的异常激活和细胞凋亡受抑制在肺癌发生、发展中可能起重要作用。PKC-βII介导的细胞增殖过度和凋亡受抑可能是肺癌发生、发展的重要机理之一。

　　关键词：肺癌；蛋白激酶CβII；凋亡；TUNEL；LSAB；肺癌的治疗

　　蛋白激酶C（Protein Kinese C， PKC）是磷脂酰肌醇信号传导途径的关键分子，至今已从不同种属的器官组织中分离、纯化出至少11种不同的PKC亚型。PKC通过使蛋白质（如膜蛋白、酶蛋白、第三信使等）的磷酸化而参与细胞生长和增殖的信号传导、调节核基因的表达和功能、影响细胞周期和程序性死亡等[1-6]。研究表明，肿瘤的发生、发展是一个多步骤的复杂过程，细胞增殖与细胞凋亡之间的平衡失调与肿瘤的发生、发展关系密切。尽管近年来关于PKC在某些恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移，多药耐药及抗肿瘤信号传导治疗方面的研究，国内外已有不少报道，但是关于肺癌中PKC的表达与细胞凋亡关系的研究，国内外尚未见报道。因此，本研究应用免疫组织化学LSAB法（Labelled streptavidin biotin method）和TdT介导脱氧核苷酸缺口末端标记技术（Terminal deoxynucleiotidy transferase mediated UTP nick end labeling， TUNEL）检测了119例人非小细胞肺癌组织，癌旁肺组织和32例肺良性疾病肺组织中PKC-βII的表达和凋亡细胞，以初步探讨PKCβII亚类在肺癌细胞增殖与凋亡中的作用。

　　1． 材料与方法

　　1．1 材料 取自1991年至1995年4月华西医大附一院胸外科手术切除的部分非小细胞肺癌标本和同期切除的肺良性疾病肺组织。术前患者均未予放疗、化疗。非小细胞肺癌患者119例，其中男性96例，女性23例。年龄31~75岁，平均54.79岁，其中＜55岁者62例，≥55岁者57例。鳞癌45例，腺癌56例，腺鳞癌18例。I期3例，II期18例，Ⅲ期74例，Ⅳ期24例。低分化癌52例，中分化癌58例，高分化癌9例。N0肺癌35例，N1-3肺癌84例。肺良性疾病包括肺结核，支扩及炎性假瘤。

　　1.2 PKC-βII表达水平和凋亡细胞的检测

　　标本用10%的中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成5μm厚的石蜡切片三张，一张行HE常规染色作形态学对照，一张行免疫组织化学LSAB法以检测PKC-βII的表达，另一张行TUNEL法以检测凋亡细胞（具体方法参照说明书）。每批免疫组化染色均设阴性空白对照（以PBS代替一抗），同时用已知阳性表达的肺癌组织切片做阳性对照。每批TUNEL法染色均设阴性空白对照（以PBS代替TUNEL混合液），同时设立阳性阳性对照（微波处理后用Dnase I 室温下消化20分钟）。PKC-βII单克隆抗体为美国Sigma公司原装产品。免疫组化试剂盒中生物素化羊抗鼠抗体及酶-链亲和素复合物为丹麦Dako公司原装产品。TUNEL药盒为德国宝灵曼公司（Boehringer Mannheim）原装试剂盒，呈色剂为Sigma公司的坚固红显色药片。

　　1．3 结果判定

　　PKC-βII基因表达产物位于胞浆及胞膜，凡胞浆显示棕黄色颗粒者为阳性（图1）。TUNEL检测凋亡细胞，凡细胞呈红色标记，并呈现出凋亡形态学特征者被认为是凋亡细胞（图2）。结果判定时，分别由两位病理科医师进行，每张切片在显微镜400倍视野中顺序找5~10个视野，每个视野数100~200个细胞，共计1000个细胞，计数阳性表达的癌细胞数，并计算出每例肺癌标本中癌细胞PKC-βII阳性表达的百分数。凋亡指数（Apoptotic Index, AI）即每100个细胞中的凋亡细胞数，计算方法同上。

　　1．4 统计分析

　　　实验数据采用t检验、F检验、直线相关分析进行统计分析。在华西医科大学统计学教研室Pentium II微机上用STATA统计软件进行处理。

　　2． 结果

　　2．1肺癌组织、癌旁肺组织和肺良性疾病肺组织中PKC-βII表达水平比较

　　肺癌组织、癌旁肺组织和肺良性疾病肺组织中PKC-βII表达阳性率分别为85.39%, 65.69%，53.22%。经F检验三组间有显著性差异（P＜0.05）。两两比较：肺癌组织中PKC-βII表达显著高于癌旁肺组织和肺良性疾病肺组织（P＜0.05），癌旁肺组织的PKC-βII表达水平显著高于肺良性疾病肺组织（P＜0.05）（表1）。

　　表1. 不同肺病变组织中PKC-βII表达水平的比较

　　tab 1. Comparison of PKC-βII expression in different lung lesion tissues

　　2.2 肺癌中PKC-βI表达水平与肺癌临床病理生理特征的关系

　　肺癌组织中PKC-βI的表达水平与不同的肺癌组织学类型、P-TNM分期、原发肿瘤大小、淋巴结转移状态、肿瘤部位、细胞分化程度，患者的性别、年龄及吸烟与否均无明显关系（P>0.05）（表2）。

表2 NSCLC中PKC-βI的表达水平与临床病理生理特征的关系

　　tab 2. The relationship between the expression of PKC-βI in NSCLC and clinical physiopathological characteristics

　　2.3 肺癌组织与肺良性疾病肺组织中细胞凋亡水平的比较

　　肺癌组织中凋亡指数（Apoptotic Index, AI）为5.27%，肺良性疾病肺组织为15.84%，经t检验两组间有显著性差异（P＜0.05）（表3）。

　　表3 不同肺病变组织中凋亡水平的比较

　　tab3. Comparison of the apoptotic index in different lung lesion tissues

　　2.4 肺癌中细胞凋亡水平与临床病理生理特征的关系

　　肺癌组织的凋亡水平与肺癌P-TNM分期，原发肿瘤大小（T）及淋巴结转移状态（N）有密切关系（P＜0.05），而与肺癌细胞分化程度、组织学类型，患者性别和年龄等均无明显关系（P>0.05）(表4)。

表4 NSCLC中细胞凋亡水平与临床病理生理特征的关系

　　tab 4. The relationship between t the apoptotic index in NSCLC and clinical physiopathological characteristics

　　2.5 肺癌组织中PKC-βII的表达水平与细胞凋亡水平之间的相关性

　　直线相关分析发现肺癌中PKC-βII表达水平与细胞凋亡水平之间呈显著负相关（P＜0.01），相关系数为-0.501。

　　3. 讨论

　　蛋白激酶C（PKC）作为一系列细胞级联信号传导途径的关键分子，其功能活化在调节细胞生长、增殖、分化及肿瘤发生、发展中起十分重要的作用，从而成为近年来肿瘤研究领域的热点之一。TUNEL法是目前国际公认的检测凋亡细胞的新技术，该法将分子生物学与免疫组化相结合，标记组织切片或细胞涂片上的凋亡细胞，敏感性及特异性均较高，且能进行凋亡细胞的定量研究^[7]。本研究应用TUNEL法定量检测119例肺癌组织及32例肺良性病变肺组织中的凋亡细胞，并与免疫组化检测同一病例切片上的PKC-βII表达相结合，以探讨细胞信号传导分子PKC-βII亚类在肺癌细胞增殖与凋亡中的作用。

　　已有较多文献报道，PKC活性在多种肿瘤组织，如乳腺癌、恶性神经胶质瘤，垂体肿瘤，口腔鳞癌及鼻咽癌等中较正常组织明显增高^[8-13]。赵冬梅等^[14]采用Western Blot法对肺恶性肿瘤及正常肺组织中PKC的活性进行了研究，发现肺恶性肿瘤组织PKC-α、-β含量较正常组织有不同程度的增高。但是，有研究表明结肠癌组织的PKC活性和DAG量低于正常的结肠组织^[15-17]；小鼠肺乳头瘤PKC活性减弱。说明在不同的肿瘤组织或细胞中PKC代谢受到的影响也不一样，从而使PKC含量以及PKC亚型发生变化。本研究采用免疫组织化学LSAB法检测了肺癌组织，癌旁肺组织及肺良性疾病肺组织中PKC-βII的表达，结果发现肺癌组织中PKC-βII表达水平显著高于癌旁组织及肺良性病变肺组织。PKC-βII表达阳性率分别为85.39%、65.69% 和53.22%（P＜0.05）。这与赵冬梅等用Western Blot法检测的结果相符合。通常认为，肿瘤的发生要经过启动阶段、促进阶段和发展阶段。在这些环节中，都有PKC参与的证据。质粒转染实验证明PKC在肿瘤启动阶段有作用。稳定过表达PKC-βI亚类的人胚肺成纤维细胞2BS具有典型的恶性表型，并可使某些原癌基因c-sis,c-Ha-ras表达增加，而抑癌基因Rb表达下降^[18，19]。促癌物质大多属于佛波酯类物，PKC是佛波酯在胞内的高亲和受体，并介导其促癌效应。其他天然促癌物质，也能竞争性地与PKC结合，其促癌活性均与激活PKC有关。PKC抑制剂staurosporine与sphingosine可抑制PKC对肿瘤的促进作用^[20]。侵袭、转移是恶性肿瘤的基本特征之一。PKC能提高肿瘤转移趋化因子受体对趋化因子的亲和力。PKC激活剂能诱导细胞的转移表型。PKC抑制剂或降低PKC活性可抑制肿瘤的转移。因此，结合本研究结果，我们推测肺癌组织中PKC-βII的异常激活可能通过介导了上述多个环节的信号传导而与肺癌的发生、发展有关。

　　目前已知，肺癌的一些病理特征诸如P-TNM分期，原发肿瘤大小、淋巴结转移状态、细胞分化程度等均与肿瘤细胞的生长速率和肿瘤细胞的生物学行为有密切关系。本研究观察到在不同的P-TNM分期中，I+II期肺癌组的凋亡指数(8.48%)显著高于Ⅲ+Ⅳ期肺癌组(4.48%)(P＜0.05)。不同的原发肿瘤大小T1+T2组的凋亡指数(6.37%)明显高于T3+T4组(4.44%)(P＜0.05)。无淋巴结转移组的凋亡指数(7.91%)显著高于有淋巴结转移组(4.05%)(P＜0.05)。由此说明肺癌中细胞凋亡水平越低，凋亡受抑制越大，机体不能正常地适时地进行细胞程序性死亡而清除变异的细胞，使得变异细胞寿命延长，异型性增大，恶性程度增高。细胞的恶性程度越高，克隆增殖的速率越快，肿瘤生长则越迅速；细胞的恶性程度越高，侵袭、转移的能力越强, 病期进展则越快。但是，本研究未观察到肺癌中PKC-βII的表达水平与不同的肺癌组织学类型、P-TNM分期、原发肿瘤大小、淋巴结转移状态、肿瘤部位及细胞分化程度有明显关系(P>0.05)。由于肿瘤的发生、发展是一个多因素参与、多步骤的复杂过程，因此，我们认为PKC-βII的激活可能仅参与了肺癌发生、发展的某部分过程。质粒转染实验观察到过表达PKC-βI的胚肺成纤维细胞呈现出恶性转化表型，如细胞形态发生变化，血清依赖性降低，锚定非依赖性生长及裸鼠体内成瘤性增加等。这只能表明在致癌多阶段过程中PKC-βI的活化发挥了重要作用。这种理想状态下的简单模型，对于人体内这样一个复杂的内环境条件下，神经体液因子间复杂的信号传导交互作用，某个因子的作用则可能被掩盖。但是，PKC作为细胞级联信号传导的关键分子，探讨它的功能活动无疑对阐明肿瘤的发生、发展具有极其重要的意义。

　　研究表明，肿瘤的发生不仅与细胞异常增殖有关，而且与细胞凋亡相关基因功能和结构异常，细胞正常凋亡级联程序受抑有关^[21，22]。细胞增殖与细胞凋亡之间的平衡失调与肿瘤的发生、发展关系密切。文献报道，多种肿瘤组织中PKC活性增加，PKC又是佛波酯等多种促癌物的胞内高亲和力受体，介导促癌效应^[23]。这说明PKC是一个反应细胞增殖的指标。而凋亡是一种由凋亡相关基因调控的自身程序化死亡，是与增殖相对抗，维持机体平衡的过程。本研究观察到肺癌组织中PKC-βII表达水平明显高于癌旁组织和肺良性病变肺组织，而凋亡水平却显著低于肺良性病变肺组织。由此提示肺癌的发生、发展是细胞增殖过度与凋亡受抑的综合结果。研究业已表明，PKC既可诱导凋亡，也可抑制凋亡。如TPA通过激活PKC，单独或与Ca2+通道激活剂协同可诱导胸腺细胞凋亡；另一方面，TPA也通过PKC抑制放射线与皮质激素所诱导的淋巴细胞的凋亡。PKC的激活剂阻止了淋巴B细胞、肾上皮细胞、人腺瘤细胞株、人滑膜细胞和依赖IL-3的体内稳态细胞的凋亡。PKC的抑制剂或PKC表达下调可诱导大鼠肝细胞、人髓样白血病细胞株及鼻咽癌细胞株的凋亡^[24-26]。而本研究发现肺癌中PKC-βII的表达水平与细胞凋亡水平呈显著的负相关（P＜0.01），即PKC-βII在肺癌组织中表达的增加伴有肺癌组织中凋亡水平的降低，从而提示PKC-βII可能介导了抑制肺癌细胞凋亡的信号传导。关于PKC介导凋亡细胞信号传导的机制，目前多数研究认为PKC可能通过使凋亡抑制基因产物（如Bcl-2）磷酸化而发挥其抑制凋亡的功能^[27]。

　　综上所述，肺癌中PKC-βII的异常激活和细胞凋亡受抑制在肺癌发生、发展中起重要作用。PKC-βII介导的细胞增殖过度和凋亡受抑可能是肺癌发生、发展的重要机理之一。然而，有关肺癌中PKC如何介导细胞增殖与凋亡的信号传导，尚有待进一步研究。

　　作者单位：华西医科大学附一院肿瘤中心，成都，四川，610041

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