光动力治疗胰腺癌的现状及展望

中国普外基础与临床杂志 1999年第6期第6卷 综述

作者：杨波　赵玉沛

单位：中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院基本外科(北京　100730)

　　胰腺癌因其确诊晚及侵袭转移特性而预后很差，5年生存率仅10%，手术切除率在20%左右。目前的姑息性治疗，如短路手术、化疗、¹²⁵I植入及术中放疗等手段并不能明显延长生存期。多程式的治疗方案虽能在一定程度上控制肿瘤生长和延长生存期，但疼痛缓解率仅45%～60%，且有可能引起肝衰、胃出血、溃疡等严重并发症。所以寻找对肿瘤选择性高，副作用小的治疗方法成为当前肿瘤治疗研究中的热点。

　　光动力治疗(photodynamic therapy, PDT)自1898年被用于治疗皮肤疾患至今已有近百年历史，但进展较慢。Weishoupt等(1976)发表了单态氧细胞毒理论，为光敏剂治疗肿瘤提供了理论依据。Dougherty等^〔1〕首先报道光敏技术用于人体恶性肿瘤的治疗。但早期的治疗仅限于体表及体腔内肿瘤。1981年Holyoke^〔2〕首次提出了光动力治疗胰腺癌的探索性应用，10余年来，进行了一定的细胞和动物实验研究，现综述如下。

　　1　PDT作用于胰腺癌细胞的实验研究

　　光动力治疗胰腺癌的细胞水平研究始于1988年，10年来国外有几个研究组进行了一定的研究，主要侧重于PDT在细胞内的作用机理，取得了一些初步结果，但对肿瘤细胞的确切杀伤机理仍不完全清楚。

　　1.1　有关PDT效应、光敏剂浓度和光剂量关系的研究

　　Thoma等^〔3〕对两株人胰腺癌细胞株MIA PaCa2和Capan2进行了PDT效应与光敏剂和光剂量之间关系的评价。肿瘤破坏过程中，PDT以光激活细胞内结合的光敏药物引起光化学反应起杀伤作用，一般认为其治疗效应与药物和光剂量是成比例的。体内条件下，光敏剂注射剂量和组织内积聚的光敏剂浓度呈线性关系，但这不包括光破坏光敏剂引起的光漂白作用。而光漂白率可以反映相应的光动力效应的减少，在临床定量中具有重要意义而不能忽略。为此Thomas等测定了两株人胰腺癌细胞的光敏素Ⅱ的有效光漂白率，发现二者光漂白曲线和速率不同，导致了光敏感性的差异。相同条件下，MIA PaCa2细胞的光敏性明显高于Capan2细胞。分析这种差异性的原因，有人认为其来自于细胞分化程度的不同^〔4〕，导致吸收光敏素中的不同成分而产生不同的光漂白率，并证明可以用三维剂量-反应模型来鉴别不同细胞间光漂白率的差异以精确定量，通过应用足够的照光剂量来提高PDT效应，他们建立了6个参数相互作用的细胞生长的非线性回归方程，发现光敏剂浓度和光剂量间不是简单的相关关系。

　　1.2　不同光敏剂在细胞中的定位和作用机理的差异

　　关于光敏剂在细胞中的定位及其发生作用的机理，Ward等^〔5〕用MTT法和MN法(微核法)检测了两种光敏剂磺化铝酞菁(ALPcS⁴)和T⁴MPyP对亚硝酸胺诱导的金黄仓鼠胰腺导管细胞癌H2T细胞的毒性作用，发现不同性质的光敏剂在细胞中的定位不同，损伤的程度在质和量上亦不相同。ALPcS⁴定位于胞浆，尤其是核糖体，而T⁴MPyP则定位于胞核。虽然存在这种差别，但不同光敏剂经光激活后，均产生高反应性单态氧及超氧阴离子等局部产物，这些活性氧族可以影响DNA完整性^〔6〕，且肿瘤组织比正常组织的DNA的敏感性更高^〔7〕。有人认为DNA修复抑制是PDT杀伤细胞的原因。被激活的ALPcS⁴和T⁴MPyP可以破坏微管组织，导致微管动力功能障碍，使分裂细胞数目减少或染色体的异常分离，形成微核，成为不可逆修复性DNA损伤的良好指标，可用于检测PDT对胰腺癌H2T细胞的作用。MTT^〔8〕是一种水溶性噻唑蓝物质，它可以在活细胞线粒体脱氢酶作用下转变为一种不溶于水的甲月　赞化合物，经异丙醇或二甲基亚砜等有机溶剂溶解后，变为蓝紫色溶液，进行光密度测定即可知活细胞数目，故MTT法可用于定量测定PDT作用后H2T细胞的存活，从细胞增殖存活角度评价PDT作用。

　　1.3　ALPcS-PDT对正常胰腺腺泡细胞和外分泌胰腺癌细胞的不同作用

　　Matthew等^〔9〕认为正常胰腺腺泡细胞和外分泌胰腺癌细胞对ALPcS的PDT反应存在着生化方面的差别。他们用淀粉酶(Amy)释放来评价PDT通过能量和钙依赖途径作用于胰腺癌细胞的机理。结果发现PDT作用抑制了AR4-2J细胞(重氮丝氨酸诱导的大鼠外分泌胰腺癌细胞)Amy的释放，且这种抑制效应依赖于ALPcS的浓度，随其浓度增加，抑制作用发生得越快越强； 同时发现细胞外钙的去除逆转了对AR4-2J细胞的这种抑制效应，使Amy释放显著增加，他们认为肿瘤细胞合成代谢分泌Amy的光动力抑制可能与钙依赖性膜靶位或通过蛋白激酶-C的激活对膜钙通道的调节有关。而对正常腺泡细胞，PDT则刺激其Amy释放，且可被游离的胞浆钙的螯合抑制，而不被细胞外钙的清除所抑制。分析PDT对正常细胞和癌细胞作用的这种差别，作者考虑到是否因腺泡结构不同所致。因为正常腺泡和AR4-2J细胞的一个明显区别在于培养条件下的AR4-2J细胞不能形成完整的腺泡。但将正常腺泡细胞分散成单个细胞后，其Amy亦增加，故排除了腺泡结构的影响。另外，为了验证AR4-2J细胞经PDT作用后是否和正常腺泡一样发生质膜的通透，测定了二者乳酸脱氢酶(LDH)的释放，证明AR4-2J细胞的质膜可被PDT通透。电镜下观察PDT前后并未见明显的细胞超微结构改变。以上提示PDT对AR4-2J细胞的抑制效应必然是由于细胞水平的不同所致，而非简单的微观解剖排列的不同。他们认为： PDT中产生的单线态氧灭活了膜蛋白和膜脂质，从而导致Amy分泌的抑制，但参与这一过程的膜成分的分子性质有待于进一步研究。

　　1.4　5-ALA可以诱导产生内源性光敏物质PPiX

　　已经证明在培养的AR4-2J细胞中加入外源5-ALA^〔10〕(5-氨基糖酸)可以诱导产生内源性光敏物质原卟啉IX(PPiX)，并积聚于细胞内，经光照后产生单态氧，引起ALA剂量依赖和光强依赖性细胞溶解； 随照光时间增加，细胞存活减少，而ALA本身不起作用。

　　2　PDT对胰腺癌动物模型的作用研究

　　胰腺癌PDT的动物实验主要集中在各种不同的光敏剂在胰腺内的优先吸收、分布和滞留，动物模型多用叙利亚金黄仓鼠。

　　2.1　双血卟啉醚的吸收和漂白动力学^〔11〕

　　用荧光检测和化学提取两种方法测定正常胰腺和实验性胰腺癌组织中双血卟啉醚(DHE)的蓄积和治疗中DHE的光漂白动力学。发现最大吸收在注药后3小时内，并在其后45小时维持高水平，同时发现正常胰腺和肿瘤组织均滞留大量DHE，但同一瘤细胞种植于皮下并生长后，DHE吸收水平低于胰腺内肿瘤。两种种植部位DHE吸收有3～4倍的差异，通常认为肿瘤血管在DHE向肿瘤的运输过程中起重要作用，如果肿瘤血供差，则经此运输的药物亦少。但这无法解释这两个不同部位肿瘤DHE吸收的差异，因为两个接种点的血供均好。大量的DHE滞留于正常和肿瘤胰腺，理论上讲二者应对PDT均有反应，但由于某些未知的原因，正常组织并未象肿瘤和其他组织那样发生坏死和出血。这种差异引出了有关正常胰腺内DHE性质的许多猜测： 是否是DHE结构使光化学反应失效或正常胰腺中存在某种保护性的单态氧抑制剂，而这种物质不存在于胰腺内肿瘤和以往研究的其他组织，亦或正常胰腺内药物缺乏光激活性，目前原因尚不清楚。但PDT这种优先破坏胰腺癌的能力，提供了胰腺癌治疗中的一个有效治疗窗。

　　2.2　胰腺癌内ALPcS的分布^〔12〕和金黄仓鼠胰腺癌的选择性坏死^〔13〕

　　用碱提取法测定BOP诱导的叙利亚金黄仓鼠胰腺癌组织中ALPcS含量，结果发现正常组织在注药后1～3小时即达峰值，至48小时很快下降，1周时再次上升而3周后再次下降。相比则肿瘤组织达累积高峰要迟，一般在24～48小时，此时最大的ALPcS肿瘤和正常组织浓度比率为3∶1，这种迟发峰和选择性决定了PDT的可能性治疗窗的存在。Schroder等用同一胰腺癌模型发现3小时ALPcS的肿瘤∶正常组织比率为2.2∶1，与HPD有很好的相关性，但观察到最大比率的时间不同，可能由于研究的时程不同。作者认为HPD和ALPcS在肿瘤组织中的积聚，可能不是由其各自的化学性质决定的，而很可能有肿瘤的某些非特异性质参与，如淋巴引流差等。

　　另外PC为含有不同磺酸基团分子的混合物，其不同基团可能有不同的组织分布，从而有不同的恶性组织吸收程度及不同的光敏能力。同一动物模型用化学提取和荧光显微镜观察正常和肿瘤胰腺的光敏剂分布，结果表明光动力剂量(光敏剂的组织浓度和光剂量的乘积)的损伤阈值正常胰腺是胰腺癌的7倍。目前的荧光显微镜研究显示肿瘤基质含有高水平的光敏剂，故在PDT中接受最高的光动力剂量。这些结果提示PDT可能对治疗小胰腺癌起作用。

　　2.3　HPD吸收和对胰腺癌的光动力治疗^〔14〕

　　研究叙利亚金黄仓鼠胰腺癌内¹²⁵I-DHE的器官分布，结果显示：DHE注射后3小时除小肠外所有器官均达DHE峰值(小肠峰值在6小时)，初始浓度以结肠、肝、脾和胰腺较高，3小时肿瘤和正常组织比率为2.4∶1。PDT对肿瘤的选择性作用可能发生在DHE注射后48小时(此期中肿瘤DHE浓度下降相对很小)，治疗后见胰腺癌区的广泛出血坏死，几乎见不到规则的肿瘤组织，而正常组织无明显改变。金黄仓鼠的胰腺癌与人的胰导管癌很相似，故极有可能人胰腺癌将对PDT敏感。最近的研究证实DHE直接注入瘤组织可得最高的肿瘤浓度，人胰腺肿瘤的体积往往足够大用以局部注射DHE。这一方法将使PDT有更高的特异性而对周围器官无副作用。

　　2.4　大鼠正常组织和实验性胰腺癌内pheophorbide A (PH-A)的分布^〔15〕和PDT^〔16〕

　　PH-A的吸收曲线示其主要靶器官为网状内皮系统，肠道、肺和胰腺，有肠肝循环，皮肤浓度很低，肿瘤内滞留时间比正常胰腺长，注射后24小时治疗比率为13.5∶1，选择性更高。其光敏能力和光损伤的基本过程已有体内外研究，但其大多数体内生物学性质知之甚少。鉴于其比HPD更小的皮肤毒性和更好的吸收波谱(665 nm)，很可能成为比HPD更有希望的光敏剂。其PDT治疗中未见皮肤和眼睛反应，故临床耐受性比HPD高。但小肠穿孔，胃溃疡，胆管瘘和血管损伤在PDT中也均有报道。

　　2.5　5-氨基糖酸-PDT治疗实验性胰腺癌动物存活期延长^〔17〕

　　ALA是血红素合成链的前体，外源给药后很快代谢为原卟啉IX(PPix)起内源性光敏化作用。在动物肿瘤模型的治疗中已取得满意疗效^〔18〕。最近Hillegersberg^〔19〕将ALA加在大鼠的饮水中分次给药，可使ALA有更好的肿瘤吸收和PPix积聚，但静脉给药ALA的PPix转化效率最高。荧光观察发现不同时间点胰腺癌和正常组织的ALA浓度比波动在1∶1和8∶1之间，最大肿瘤坏死深度为8 mm，提示在外科肿瘤减灭术后，足以作为辅助治疗。治疗组和对照组相比生存期明显延长。

　　3　目前存在的主要问题

　　虽然以上的实验研究获得了有关胰腺癌PDT作用的初步结果，但也提出了在其正式临床应用前必须解决的一些问题：①胰腺癌位置较深，很难通过体表照射或经腔内窥镜进行，而且瘤体一般较大，限于目前所用激光波长(630 nm)功率低，穿透能力较弱，光斑面积小，对较大体积肿瘤难以达到根治要求； ②体内杀伤肿瘤的机理比体外培养细胞的情况复杂得多，有关PDT对肿瘤细胞的作用机理仍远未能作出一种普遍接受的详尽解释； ③动物实验所用化学诱导的胰腺癌模型与人体的胰腺癌的相似性究竟有多大，目前所得到的有关结果究竟在多大程度上能反映人胰腺癌的治疗效果，尚难以确定； ④避光问题，各种光敏剂在体内存留的时间长短不一。目前国内临床PDT治疗中最常用的HPD，在体内存留可长达84～120天，患者需避光至少1个月，皮肤光敏反应仍有发生，患者依从性较差； ⑤PDT后DNA和RNA聚合酶失活^〔5〕，DNA损伤和修复功能下降。DNA对PDT的敏感性涉及到它是否有致突变和致癌作用的问题； ⑥动物实验中有坏死性胰腺炎、十二指肠及胃幽门前穿孔、胆瘘和血管损伤等报道，所以治疗过程中周围器官的保护和治疗选择性有待于加强。

　　4　应用前景

　　①新的光敏剂的研制和新型高功率激光器的应用，将有可能解决光敏剂吸收量小，所需避光时间长和光穿透力局限等问题。如锌酞菁体内存留时间经小鼠实验证明仅15天^〔20〕。而倍频Nd：YAG激光和大功率He-Ne激光器的应用，使PDT效应明显提高； ②综合治疗程序的确定，PDT与放疗结合的放射增敏效应，与单克隆抗体交联的PDT导向治疗^〔21〕，与ADM、氨甲喋呤等化疗药物的协同作用进一步扩大了适应证，提高了疗效并减少了副作用； ③组织间光纤技术的应用^〔22〕，不仅克服了光穿透力的局限性，而且对肿瘤周围正常组织产生的影响更小； ④已有实验证实，正常胰腺组织的光动力剂量损伤阈值是肿瘤组织的7倍，提示了PDT用于胰腺癌治疗的潜在优势； ⑤有实验证明，癌前期肿瘤细胞具有自发荧光，如能测定出来，将为肿瘤普查和早期诊断带来新的突破。

　　虽然胰腺癌的光动力治疗尚未应用于临床，但已有的研究结果让人们看到了很有希望的应用前景，光动力治疗很有可能成为胰腺癌姑息性治疗的一种手段和根治性手术的辅助治疗方法。

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(1999-05-21收稿)