乳腺癌腋窝淋巴结微小转移灶的检测及其意义

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第12期

李金锋　林本耀　徐光炜

　　关键词：乳腺癌腋窝淋巴结微转移

　　乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤(31％)，其死亡率仅次于肺癌而位居第二^[1]。恶性肿瘤细胞的转移是主要致死因素，而淋巴道转移是主要转移途径之一。据统计，常规病理检查淋巴结阴性患者仍有20％～30％于手术后5年内出现远处转移。所以准确检测淋巴结转移情况对指导治疗和判断预后都十分重要。本文就近年来有关乳腺癌腋窝淋巴结微转移检测的进展及其意义作一综述。

　　1　微小转移灶的定义

　　根据转移淋巴结的侵犯程度，将其分成微转移灶(micro－)和大转移灶(macro－)，划分标准亦不统一。1971年Huvos等以2mm直径之转移灶为界，首先引入微转移的概念，继之，Fisher又将微转移灶定为＜1.3mm^[2]。更有学者将微转移灶定为肿瘤浸润范围小于受累淋巴结切面的20％，这一指标更具随意性，因为淋巴结体积变化很大，而且多种原因均可招致淋巴结肿大。多数学者认为2mm直径作为微转移灶之上限较为适宜，因为2mm以上的瘤灶很易为常规病理检查所发现。

　　2　微小转移灶的检测方法及检出率

　　2.1　连续组织病理切片检查(SerialSectioning)

　　半个世纪以前Saphir＆Amromin明确指出，由淋巴结中间切取几张切片行苏木精－伊红(H＆E)染色检测癌转移有很多不足之处^[3]。尽管如此，这种方法仍是目前大多数病理科常规应用的标准方法。若行连续切片H＆E染色，能增加检出率7％～33％。根据切片间隔的不同，结果有很大差异。Ludwig小组将每个淋巴结分成六个层次，每层切取6张3μm切片，结果仅提高检出率9％^[4]。Pickren间隔12μm行连续切片，97例中发现24例隐性转移灶(22％)。Fisher则间隔5μm，然后每切4张切片取第4张行H＆E染色，其理由是：癌细胞直径一般大于20μm，所以每隔20μm检测1张切片可以囊括全部转移灶，结果在78例中检测出19例(24％)。Saphir＆Amromin行无间隔连续切片，每两张检测一张，结果在30例中检测出10例(33％)。由此可见，连续切片检查与常规组织病理比较，确能提高肿瘤微转移的检出率，但由于其繁重的工作量很难在临床常规实行。

　　2.2　免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)染色

　　IHC是70年代末建立起来的利用特异性抗原抗体反应，观察和研究组织细胞特定抗原(抗体)的定位和定性技术，与H＆E染色相比，IHC应用不同单克隆抗体(MoAb)检测乳腺癌淋巴结，10％～23％为阳性，提高检出率14％～17％^[5～7]。浸润性小叶癌比其它病理类型的检出率更高些，因为这些单个细胞或细胞簇在常规染色下可能被误认为正常组织细胞。若行连续切片再行IHC检测，其隐性癌灶的检出率将会更高，McGuckin^[8]每100μm间隔切取4张切片行IHC，结果208例中53例查出隐性灶(25％)，其中67％的转移灶最大直径小于0.5mm。但是，对所有腋窝淋巴结均做连续切片和IHC检查，不仅工作量大，昂贵的价格亦使临床应用受到极大限制。

　　2.3　分子生物学检测

　　近年来，随着分子生物学技术的进步，新的检测手段不断涌现，其中利用反转录聚合酶链反应(RT－PCR)技术检测肿瘤细胞中特定标志物mRNA水平的表达，已经用于乳腺癌微转移灶的检测。众所周知，聚合酶链反应(PCR)技术是近年来应用最多的分子生物学技术，它能在几小时之内将目的核酸扩增10⁶～10⁹倍，扩增片断长度由40～50bp至10000bp。RT－PCR为PCR技术的扩展，虽然它是对特定基因mRNA表达的检测，但首先要在逆转录酶作用下将mRNA转录为cDNA，然后再行常规扩增。应用PCR方法检测肿瘤细胞最早报道于1988年对慢性髓细胞性白血病(CML)的监测，对实体瘤

　　始于1991年对外周血中恶性黑色素瘤细胞的检测。由于PCR技术可检测到1/107的恶性细胞^[9]，故其比IHC方法敏感10～100倍，成为目前检测乳腺癌淋巴结转移最敏感的方法之一，能在常规组织学检查阴性的淋巴结中发现9％～38％的微转移^[10～12]。

　　3　用于检测转移肿瘤细胞的生物学标志物

　　检测转移肿瘤细胞，需利用能区别于转移部位组织而肿瘤细胞特异表达的生物学标志物。如恶性黑色素瘤中酪胺酸酶(Tyrosinase)基因的表达，前列腺组织中PSA的表达等。截止目前尚未发现乳腺组织特异性标志物，尽管Maspin基因对乳腺组织较为“特异”，但其在乳腺外转移部位仅有20％～35％的表达^[13]。

　　由于乳腺癌绝大多数都发源于上皮组织，所以上皮组织的某些特异性标志物即可做为转移肿瘤细胞的标志物，用于淋巴结中微转移灶的检测，其中研究较多的为细胞角蛋白(Cytokeratin)19。几乎所有正常上皮细胞、上皮性肿瘤均有CK－19表达(皮肤和肝细胞除外)，而非上皮来源的细胞通常不表达。针对这一特点，早在1985年Bartek等即用CK－19MoAb检测其在乳腺组织和肿瘤中的表达。以后有多篇报道采用IHC或RT－PCR等不同手段对不同组织进行了CK－19的检测，其中Noguchi等检测了126例乳腺癌患者的腋窝淋巴结，常规病理发现20例(10％)转移，RT－PCR发现33例(26％)，而在91例常规病理检测阴性病例中有15例(16％)CK－19阳性^[12]。Schoenfeld等以CK－19为标志联合检测骨髓和外周血，结果显示IHC检测骨髓和外周血，CK－19阳性率分别为22％和5％，RT－PCR方法增至35％和25％，二者有显著性差异^[14]。最近，Kwaspen实验证实K－19单抗RCK108与其它角蛋白抗体相比具有高度敏感和分布广泛的特性，可用于常规处理石蜡切片上皮性肿瘤的检测^[15]。

　　表皮糖蛋白基因(EGP－2)是上皮细胞的又一标志基因，在上皮细胞正常表达，并编码38KD的跨膜糖蛋白。几乎所有上皮来源的肿瘤均表达EGP－2，而非上皮来源的肿瘤，如淋巴瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤和恶性黑色素瘤等则无表达。EGP－2基因的cDNA于1989年被克隆并测序，其表达蛋白能被MoAbMoC－31所识别，并显示与正常血液细胞无交叉反应性。已有数篇应用单抗MoC－31检测小细胞肺癌(SCLC)骨髓、外周血及胸水中的癌细胞。DeGraaf等研究显示四种乳腺癌细胞系均有EGP－2基因的高表达^[16]，故EGP－2基因亦有望用于乳腺癌微转移灶的检测。

　　黏蛋白MUC1是又一检测乳腺癌淋巴结微转移的生物学标志物，其为一种高分子糖蛋白，主要存在于某些上皮性组织和器官中，如乳腺、胰腺、卵巢和结肠等，特别是在所有正常及癌变组织中均表达，而在间叶组织中不表达。但有报道检测CK－19基因表达比MUCI敏感10倍^[10]。

　　其它用于检测乳腺癌微转移的标志物尚有上皮膜抗原(EMA)、β－HCG、CEA以及角蛋白复合抗体AE1、AE3、CAM5.2等。

　　4　微小转移灶与预后的关系

　　目前，关于隐性微小转移灶对患者预后的影响仍有争议。早期研究认为，微转移对患者的生存无任何不利影响，这些小的肿瘤细胞巢无临床意义。以至于普遍认为寻找这些微小转移灶徒劳无益。随着研究的不断深入，原有的观点难以立足。经动物实验观察到，由骨髓分离出来的少量转移肿瘤细胞能在体外存活，将其接种于裸鼠体内具有成瘤性^[17]。Rosen等发现对于T1肿瘤患者，即使淋巴结转移灶直径＜2mm，经10年随访，其无病生存期(DFS)和总生存期(OS)均会缩短，而对T2期患者则影响不著。Claton和Hopkins也认为小的淋巴结转移灶对患者的影响取决于原发肿瘤的大小。Demascard等的观察认为与淋巴结阴性患者相比，即使出现单个转移细胞，对患者的复发和生存期均有明显差异^[18]。在近15年的大宗病例报道中(＞100例)均显示隐性转移灶至少在一组患者中降低DFS或OS。其中Ludwig小组的报道为第一篇大宗前瞻性研究，发现有微转移的患者5年DFS下降16％，OS下降9％^[9]。迄今为止，Hainsworth等于1993年报道应用IHC方法检测淋巴结微小转移灶的病例数最多，共检测了343例常规检查阴性者，结果阳性率占12％，其5年DFS下降28％^[19]。而另一组报道10年OS下降25％。转移灶仅为0.2mm亦对生存期产生影响^[8]。

　　早期的研究报道，关于隐性转移灶对患者生存期的影响多持否定态度，而近年来的报道则一致认为，隐性转移灶的有无会直接影响患者的预后。这与观察病例的多少、随访时间的长短及IHC染色技术的应用有密切关系。许多研究没能发现生存率的差异是由于观察例数不足或随访时间过短所致，而发现有生存差异的报道均为大宗病例(147～921)，

　　且随访期至少6年。Rosen等人研究发现，淋巴结有微转移的患者与淋巴结检测阴性患者生存率的比较，随访6年虽无差异，但随访10年，有转移的患者其生存率明显降低，而与具有明显转移灶患者的结果相一致，提示欲判定微小转移灶对患者预后的影响至少需要观察10年以上。

　　关于PCR方法检测出的微小转移对患者预后的影响，由于此项研究开展时间较短，目前尚无定论。有人认为，淋巴结作为正常和肿瘤上皮细胞的清理部位，阳性信号可能仅代表免疫系统清除和过滤循环中肿瘤细胞的一种功能反应^[20]。这样可能导致PCR反应特异性的降低，如何区别这种淋巴结中非转移PCR阳性信号有待进一步探索。

　　5　小结与展望

　　乳腺癌发病率有逐年增加的趋势，且淋巴结转移阴性患者手术后5年内死亡率仍有20％左右，如何对这些患者做出正确判断并予相应的强化治疗，为今后肿瘤学家所追求之目标。随着检测手段的不断完善，新技术、新方法的不断涌现，多部位多项目的联合检测，定会对乳腺癌的微小转移灶做出更加精确的评估。尽管目前对某些高度灵敏的方法检测出的微小转移灶的生理意义尚存争议，但至少提示其具有转移倾向，并可作为判断预后的独立参考指标。对未检出转移的患者可免除不必要的强化治疗。随着观察病例的增多和随访时间的延长，微小转移灶的临床意义会更加明显。

　　作者单位：北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院乳腺外科(北京市100036)

　　参考文献

　　1 Parker SL,Tong T,Bolden S,et al. Cancer statistics 1996. CA, 1996;46:5

　　2 Fisher ER,Swamidoss S,Lee CH, et al. Detection and significance of occult axillary node metastases in patients with invasive breast cancer. cancer,1978;42:2032

　　3 Saphir O,Amromin GD. Obscure axillary lymph node metastases in carcinoma of the breast. Cancer,1948;1:238

　　4 International (Ludwig) Breast Cancer Study Group. Prognostic importance of occult axillary lymph node metastases from breast cancer. Lancet,1990;335:1565

　　5 Nasser LA,Lee A,Bosari S,et al. Occult axillary lymph node metastases in “ node－ negative” breast carcinoma. Hum Pathol,1993;24:950

　　6 Berry N, Jones D,Marshall R,et al. Comparison of the detection of breast carcinoma metastases by routine histological diagnosis and by immunohistochemical staining. Eur Surg Res,1988;20:225

　　7 Sedmak DD,Meineke T,Knechtges DS. Detection of metastases breast carcinoma with Mo－ Ab to cytokeratins. Arch Pathol Lab Med,1989;113:786

　　8 Mc Guckin MA,Cummings MC,Walsh MD,et al. Occult axillary node metastases in breast cancer:their detection and prognostic significance. Br J cancer,1996;73:88

　　9 Mattano LA,Moss TJ,Emerson SG. Sensitive detection of rare circulating neuroblastoma cells by the reverse transcribptase－ polymerase chain reaction. cancer Res,1992;52:4701

　　10 Noguchi S,Aihara T,Motomura K et al. Detection of breast cancer micrometastases in axillary lymph nodes by means of reversetranscriptase－ polymerase chain reaction. Am J Pathol,1996;148:649

　　11 Schoenfeld A,Luqmani Y,Sinnett HD,et al. Keratin－ 19 mRNA measurement to detect micrometastases in lymph node in breast cancer patients. Br J cancer,1996;74:1639

　　12 Noguchi S, Aihara T, Motomura K,et al. Histologic characteristics of breast cancers with occult lymph node metastases detected by keratin 19 mRNA reverse transcriptase－ polymerase chain reaction. Cancer,1996;78:1235

　　13 Luppi M,Morselli M,Bandieri E,et al. Sensitive detection of circulating breast cancer cells by reverse－ transcriptase polymerase chain reaction of maspin gene. Ann Oncol,1996;7:619

　　14 Schoenfeld A,Kruger KH,Gomm J,et al. The detection of micrometastases in the peripheral blood and bone marrow of patientswith breast cancer using immunohistochemical and reversetranscriptase－ polymerase chain reaction for keratin 19. Eur J Cancer,1997;33:854

　　15 Kwaspen FHL,Smedts FMM,Broos A,et al. Reproducible and highly sensitive detection of the broad spectrum epithelial marker keratin 19 in routine cancer diagnosis. Histopathology,1997;31:503

　　16 De Graaf H,Melandsmo GM,Ruud P,et al. Ectopic expression of target genes may represent an inherent limitation of reverse transcriptase－ polymerase chain reaction assays used for micrometastases detecton: Studies on the epithelial glycoprotein gene EGP－ 2. Int J Cancer,1997;72:191

　　17 Cote RJ,Rosen PP,Lesse ML,et al. Prediction of early relapse in patients with operable breast cancer by deteciton of occult bone marrow micrometastases. J clin Oncol,1991;9:1749

　　18 De mascard I,Binichon F,Coindre JM,et al. Prognostic significence of breast cancer axillary node micrometastases assessed by two special techniques:re－ evaluation with longer follow－ up. Br J Cancer,1992;66:523

　　19 Hainsworth PJ,Tjandra J, Stillwell RG,et al. Detection and significance of occult metastases in node－ negative breast cancer. Br J Surg,1993;80:459

　　20 Raj GV,Moreno JG,Gomella LG. Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumors. Cancer,1998;82:1419