实验性大鼠乳腺癌基因研究进展
中国普外基础与临床杂志 1999年第1期第9卷 综述
摘要 建立人结肠癌细胞株SW480裸鼠移植瘤模型，观察8肽生长抑素(SMS 201-995，SMS)对移植瘤的作用及机理。结果∶SMS组及SMS+PG(5肽胃泌素)组移植瘤的体积、重量、瘤细胞内cAMP、DNA、蛋白质含量、S期和G2M期细胞数及增殖指数均显著低于PG组及对照组，PG组显著高于对照组；而G0/G1期细胞数则显著高于PG组及对照组，PG组显著低于对照组。本实验结果提示：生长抑素具有直接抑制人结肠癌细胞株SW480移植瘤生长的作用，又可抑制胃泌素对移植瘤的促增殖作用。这种作用机理是通过抑制瘤细胞内cAMP、DNA和蛋白质的合成，从而抑制瘤细胞从G0/G1期进入到S期和G2M期。这为大肠癌患者应用生长抑素类似物进行内分泌治疗提供了实验依据。
THE EFFECT OF SOMATOSTATIN ON THE
TRANSPLANTED HUMAN COLONIC CARCINOMA AND
ITS MECHANISM IN GYMNOMOUSE BODY
He Shuangwu, Zhao Yanming, Shen Kangqiang.
Department of General Surgery, Daping Hospital and Research Institute of Surgery, Third Military Medical University,Chongqing 400042
Abstract The model of transplanted colonic SW480 cell line carcinoma in gymnomouse body was set up to observe the effect of octapeptide somatostatin (SMS 201-995,SMS) on the transplanted carcinoma and elucidate its mechanism. Results: the volume, weight, DNA and protein content in carcinoma cell, cell amount and proliferation index of S and G2M phase in SMS group and SMS+PG (pentagastrin) group were markedly lower than those in PG group and control group, those of PG group were markedly higher than those in control group.The cell amount of G0/G1 phase in SMS group and SMS+PG group was markedly higher than that in PG group and control group, and that of PG group was markedly lower than that in control group.All these suggested that somatostatin could not only inhibit the growth of transplanted human colonic SW480 cell line carcinoma directly but also inhibit the growth-promoting effect of gastrin on the transplanted carcinoma.The mechanism might be that somatostatin inhibit the synthesis of cAMP, DNA and protein in carcinoma cells, then inhibit the cell growing from G0/G1 phase to S and G2M phases.Our study might provide experimental basis for the homonotherapy with analogue of somatostatin in patients with large intestine carcinoma.
Key words Colonic carcinoma Somatostatin Gastrin Gymnomouse Transplanted carcinoma
近年来一些研究表明，胃泌素能促进部分大肠癌的增殖，而生长抑素(somatostatin，SS)具有抑制其生长的作用。为探讨生长抑素对大肠癌的作用机理及临床意义，本研究通过建立人结肠癌SW480细胞株裸鼠移植瘤模型，观察在8肽生长抑素(SMS 201-995，SMS)作用下，移植瘤的体积、重量、瘤细胞内环磷酸腺苷(cAMP)、DNA和蛋白质含量及细胞周期动力学变化。
1 材料与方法
1.1 材料
人结肠癌细胞株SW480(美国纪念斯隆-凯特林癌症中心建株，重庆医科大学病理生理教研室提供)，BALB/c裸鼠(第三军医大学实验动物中心)，SMS(PHARMA，瑞士)，5肽胃泌素(PG，上海丽珠生化试剂公司)、cAMP放免分析试剂盒(上海第二医科大学核医学教研室)。
1.2 移植瘤模型的建立
将人结肠癌细胞株SW480按常规方法复苏，初代移植瘤采用生长旺盛的细胞株，用0.25%胰蛋白酶消化后，离心去消化液，用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为5×106／ml，台盼兰染色活细胞计数＞99%。取裸鼠12只，鼠龄4～6周，体重18～22g，雌雄兼用，分6次传代，每代接种2只。在鼠颈部背侧皮下接种瘤细胞液0.2ml，饲养于净化室内。待肿瘤直径长至1.5～2.2cm，断颈椎处死，无菌剥离瘤体，留取组织学及电镜标本后，剪碎，加RPMI 1640培养液，研磨成细胞悬液，调整细胞浓度为5×106/ml，取0.2ml按上述方法接种传代。
1.3 实验分组
经传代后，生长稳定的人结肠癌转移瘤按前述方法接种于20只裸鼠，随机分为4组，每组5只，接种次日开始给药，连续用药35天，末次用药24小时后处死裸鼠。
1.3.1 对照组 生理盐水0.4ml/只，皮下注射，1天2次。
1.3.2 SMS组 SMS 6μg/只，皮下注射，1天2次。
1.3.3 PG组 PG 4μg/只，皮下注射，1天2次。
1.3.4 SMS+PG组 PG 4μg/只+SMS 6μg/只，皮下注射，1天2次。
1.4 检测方法
1.4.1 移植瘤体积 接种后每6天同一时间测量1次移植瘤的长径(a)和短径(b)，按公式V＝
a2b计算体积，连续观察6周。
1.4.2 移植瘤瘤重 将剥出的肿瘤去除血污、脂肪等非瘤组织，测量瘤重。
1.4.3 病理组织学及超微结构 取第6代移植瘤组织，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察。将第6代移植瘤低温下切取1mm×1mm×1mm大组织2块，6%戊二醛和1%锇酸固定，丙酮脱水，EPON-812包埋，超薄切片，钾-铅双染色，在300型透射电子显微镜下观察。
1.4.4 血清及移植瘤组织CEA含量测定 第2、4、6代荷瘤鼠处死前经眼内眦取血1ml，分离血清。切取瘤块剪碎，加入PBS液，反复冻融3次，离心(4 000r/min)15分钟取上清液，采用放免法测血清及瘤组织CEA含量。
1.4.5 移植瘤细胞内cAMP含量测定 称取50mg湿重瘤组织，剪碎，加入1 mol的过氯酸1 ml，匀浆后离心，加20%KOH中和后再离心，取上清液50μl，按试剂盒说明测cAMP。
1.4.6 流式细胞术 切取移植瘤组织约15g，制成单细胞悬液〔1〕，调整细胞浓度为1×105／ml，4℃、70%乙醇固定。用碘化丙啶(PI)染色DNA呈红色荧光，异硫氰酸(RITC)染色蛋白质呈绿色荧光，置室温30分钟后上机分析。采用Barlogie细胞周期分析法，将处于不同时期的细胞分成3部分，即G0/G1期、S期和G2M期。细胞增殖指数(PI)按以下公式计算：
1.5 统计学处理
数据以
±s表示，采用t检验。
2 结果
2.1 人结肠癌裸鼠移植瘤模型及生物学特性
移植瘤接种成功率为100%，无1只死亡。潜伏期6～8天，生长速度至第6代基本稳定，第5周末肿瘤长径可达1.6～2.0cm，早期为椭圆形，表面光滑，后期为不规则形，表面呈结节状。移植瘤组织学HE染色及超微结构具有人结肠癌的病理组织学特征。荷瘤鼠血清CEA含量2、4及6代平均值为13.8μg/L，正常裸鼠血清CEA为2.2μg/L；移植瘤组织CEA平均为17.2μg/g。
2.2 生长抑素对人结肠癌裸鼠移植瘤的作用
实验结束时荷瘤鼠全部成活，SMS组及SMS+PG组移植瘤的体积、重量、瘤细胞内cAMP、DNA、蛋白质含量、S期和G2M期细胞数及增殖指数均显著低于PG组及对照组，PG组显著高于对照组；而G0/G1期细胞数则显著高于PG组及对照组，PG组显著低于对照组(见表1～3)。
表1 SMS对人结肠癌裸鼠移植瘤体积和重量的影响(±s)
| 组别 |
n |
体积(mm3) |
重量(g) |
| 对照组 |
5 |
1765.54±35.68 |
3.04±0.13 |
| SMS组 |
5 |
209.78±12.60**△ |
0.90±0.14**△ |
| PG组 |
5 |
1926.10±97.92** |
3.37±0.21* |
| SMS+PG组 |
5 |
224.20±19.44**△ |
0.95±0.12**△ |
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与PG组比较，△P＜0.01
表2 SMS对人结肠癌裸鼠移植瘤细胞内cAMP、DNA及
蛋白质含量的影响(±s)
| 组别 |
n |
cAMP(pmol/ml) |
DNA(D) |
蛋白质(D) |
| 对照组 |
5 |
2.74±0.14 |
946.56±16.31 |
363.86±11.64 |
| SMS组 |
5 |
1.87±0.14*△ |
684.48±13.29*△ |
271.80±10.61*△ |
| PG组 |
5 |
3.18±0.23* |
1003.78±16.86* |
675.28±17.80* |
| SMS+PG组 |
5 |
1.86±0.17*△ |
687.24±21.17*△ |
273.62±12.73*△ |
与对照组比较，*P＜0.01；与PG组比较，△P＜0.01
表3 SMS对人结肠癌裸鼠移植瘤细胞周期及增殖指数的影响(±s)
| 组别 |
n |
G0/G1 |
S |
G2M |
PI(%) |
| 对照组 |
5 |
64.92±1.72 |
18.24±1.20 |
16.84±2.35 |
35.08±1.72 |
| SMS组 |
5 |
80.04±2.29**△ |
14.90±1.46*△ |
5.06±1.61 |
19.96±2.39**△ |
| PG组 |
5 |
59.22±1.18** |
20.16±1.06* |
20.62±2.05* |
40.78±1.81** |
| SMS+PG组 |
5 |
80.26±2.73**△ |
15.22±1.78*△ |
4.54±1.25**△ |
19.22±2.73**△ |
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与PG组比较，△P＜0.011
3 讨论
生长抑素是由D细胞分泌的一种环状多肽类激素，主要分布在胃肠道及中枢神经系统，其中胃肠道占70%，主要作用是抑制胃肠道粘膜的增殖、分泌和吸收，抑制胃泌素、胰泌素、胰高血糖素和生长激素的释放，称之为内分泌激素的总开关。Itztu等〔1〕用免疫组化法发现大肠癌粘膜中存在D细胞，认为大肠粘膜中D细胞对其它激素的分泌可能有局部调节作用，如抑制G细胞中胃泌素mRNA的转录，从而抑制胃泌素的合成及释放。
一些作者认为大肠癌是激素依赖性肿瘤，胃泌素可促进其增殖，而生长抑素具有抑制大肠癌发生和发展的作用〔2〕。Radulovic等〔3〕将人大肠癌细胞株HT 29种植于裸鼠，应用生长抑素衍生物RC-160后，可明显抑制载瘤鼠肿瘤的生长。Dy等〔4〕报告SMS 201-995能明显地抑制人结肠癌细胞株LIM 2405及LIM 2412移植瘤的生长，且具有浓度依赖关系。本实验建立的人结肠癌SW480裸鼠移植瘤模型，保持了结肠癌生物学特性。于裸鼠移植瘤皮下注射SMS 6μg/只*天，连续35天后，SMS组及SMS+PG组移植瘤的体积、重量、瘤细胞内cAMP、DNA、蛋白质的含量、S期、G2M期细胞数及增殖指数均显著低于对照组及PG组，而G0/G1期细胞数则显著高于对照组及PG组。表明8肽生长抑素对移植瘤具有负性调控作用，不仅能直接抑制人结肠癌细胞株SW480的生长，而且可抑制胃泌素对移植瘤的促增殖作用，阻断癌细胞从G0/G1期进入到S期和G2M期，从而抑制癌细胞的分裂和增殖。
生长抑素抗肿瘤作用的机理是：生长抑素与癌细胞膜上特异性的生长抑素受体结合，产生直接的抗增殖效应，包括磷酸酪氨酸磷酸酶的激活，抑制cAMP及基因转录，抑制胃泌素、蛙皮素、表皮生长因子等的合成、释放及作用而具有间接的抗增殖作用；还能抑制与肿瘤有关的血管形成〔3，5，6〕。
本研究为临床应用生长抑素类似物进行辅助治疗提供了实验依据。生长抑素半衰期小于2分钟，不能药用，而人工合成的生长抑素类似物如SMS 201-995、RC-160已用于临床。Cascinu等〔7〕应用SMS 201-995治疗55例不能耐受化疗的晚期消化道肿瘤患者，可缓解症状，提高生活质量，延长患者的生存期。随着基因工程的发展，有待研制作用时间更长、疗效更强的生长抑素类似物，为大肠癌患者进行内分泌等非细胞毒性治疗开辟新途径。
参 考 文 献
1 Itzeu BD, Lolova I, Davidoff M.Immunocytochemical and electromicroscopical data on the differentiation of somatostatin-cantaining cells in human lage intestin. Anat Anz Jena, 1988; 166(2)∶77
2 Smith JP, Solomon TE. Effects of gastrin, proglumide and somatostatin on growth of human colon cancer. Gastroenterology, 1988; 95(6)∶1541
3 Radulovic S, Schally AV, Reile H, et al. Inhibitory effects of antagonists of bombesin/gastrin releasing peptide (GRP) and somatostatin analog (RC-160) on HT-29 human colon cancers in nude mice. Acta Oncol, 1994; 33(6)∶693
4 Dy DY, Whitehead RH, Morris DL. SMS 201-995 inhibits in vitro and in vivo growth of human colon cancer. Cancer Res, 1992; 52(2)∶917
5 Singh P, Syle S, Townsend CM. A long acting somatostatin analog (SRIF) (201-995) and proglumide (PGL) inhibit the trophic and gastrin receptor (GR) regulatory of effects of pentagastrin (PG) on mouse colon cancer (MC-26) cells in vivo. Gastroenterology, 1986; 90(10)∶1636
6 黄广建. 生长抑素在肿瘤诊治中的应用. 国外医学外科学分册， 1996； 23(2)∶84
7 Cascinu S, Ferro EO, Catalano G. A randomized trial of octreotide vs best supportive care only in advanced gastrointestinal cancer patients refractory to chemotherapy. Br J Cancer, 1995; 71(2)∶97
(1998-03-26收稿)
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